The differential expression of nephrin according to glomerular size in early diabetic kidney disease

Abstract

[한글]배경: 당뇨병성 신병증은 투석이나 신이식이 필요한 말기 신부전증의 원인 질환 중 가장 많은 빈도를 차지하는 질환으로, 임상적으로는 단백뇨가 특징적인 소견이다. 최근의 연구에 의하면 당뇨병성 신병증을 포함한 대부분의 사구체 질환에 의한 단백뇨는 사구체 여과 장벽의 이상에 의하여 발생하는 것으로 보고되고 있다. 사구체 여과 장벽 중 알부민보다 크기가 작은 분자에 대한 여과 장벽 역할을 하는 것으로 알려져 있는 세극막은 서로 다른 족세포에서 기원한 족돌기들을 연결시켜 주는 섬유상의 구조로, 4 x 14 nm의 세공을 가지고 있다. 이러한 세극막을 구성하는 대표적인 분자로 nephrin이 있는데, 단백뇨를 동반하는 여러 실험적 동물 모델과 성인 신증후군 환자에서 nephrin의 발현이 감소되었다는 보고들이 있다. 그러나 당뇨병성 신병증의 경우 연구자에 따라 nephrin의 발현이 감소 또는 증가되었다고 보고하여, 서로 상반된 결과가 있는 실정이다. 이에 본 연구자는 당뇨병성 신병증에서 사구체 비후가 모든 사구체에서 동시에 일어나지 않을 것이라는 가정 하에 뇨단백 배설이 증가되기 시작하는 당뇨병성 신병증 초기에 비후된 사구체와 정상 크기의 사구체 사이에 nephrin의 발현에 차이가 있는 지를 알아보고자 하였다.방법: Streptozotocin으로 당뇨를 유발시킨 백서 (Sprague-Dawley rats) 10 마리 (DM)와 대조군 배석 10마리 (C)를 대상으로, 당뇨 유발 6주 후에 체공 크기가 250 ㎛, 150 ㎛, 125 ㎛, 그리고 75 ㎛인 sieve를 이용하여 사구체를 분리하였다. 이 과정을 통하여 분리된 사구체 중 125 ㎛ sieve에 걸린 사구체를 비후된 사구체 (large glomeruli, LG), 그리고 75 ㎛ sieve에 걸린 사구체를 작은 사구체 (small glomeruli, SG)로 분류하여 실험하였다. 사구체 용적은 영상 분석기를 이용하여 산출하였으며, nephrin의 mRNA 발현은 실시간-중합효소 연쇄반응 (real time-PCR)으로, 그리고 단백 발현은 Western blot을 이용하여 분석하였다.결과:1. 사구체의 평균 용적은 DM-LG (1.68 ± 0.08 x 106 ㎛3)와 C-LG (1.47 ± 0.09 x 106 ㎛3)에서 DM-SG (1.08 ± 0.04 x 106 ㎛3)와 C-SG (0.97 ± 0.03 x 106 ㎛3)에 비하여 유의하게 컸다 (p<0.01).2. C-SG의 nephrin mRNA 발현을 1로 하였을 때, DM-LG와 DM-SG에서의 nephrin mRNA 발현은 각각 0.49 ± 0.10과 1.71 ± 0.21로, nephrin의 mRNA 발현이 DM-LG에서 의미있게 감소되었던 반면에 DM-SG에서는 의의있게 증가되었다 (p<0.05). 한편, 18s의 mRNA 발현은 모든 군에서 유사하였다.3. Nephrin의 단백 발현도 mRNA의 발현과 유사하였다. C-SG에 비하여 DM-LG에서 세포외 및 세포내 nephrin의 단백 발현이 각각 77%, 86% 감소되었던 반면에 DM-SG에서의 발현은 각각 56%, 92% 증가되었다 (p<0.05). 한편, Wilm's tumor-1과 β-actin의 단백 발현은 모든 군에서 유사하였다.결론적으로, 사구체 크기에 따라 nephrin 유전자의 발현에 차이가 있었으며, nephrin의 발현이 감소되어 있는 비후된 사구체가 초기 당뇨병성 신병증에서 동반되는 단백뇨와 관련이 있을 것으로 생각된다.

[영문]Background: Diabetic nephropathy (DN) is clinically characterized by proteinuria. The underlying pathologic change responsible for proteinuria in various glomerular diseases is the loss of size-selective and/or charge-selective properties of the glomerular filtration barrier. Traditionally, the GBM has been considered a coarse filter that restricts large molecules, while the slit diaphragm was thought to function as a fine filter that contributes to ultimate size-selectivity, permitting permeability only to molecules smaller than albumin. The molecular structure of the slit diaphragm is still unclear, but recent studies have revealed a few genes located at the region of the slit diaphragm. Nephrin, a product of the NPHS1 gene was the first protein demonstrated to comprise the slit diaphragm. Many studies tried to demonstrate a relationship between proteinuria and changes in nephrin in various forms of glomerular diseases including DN, but the results are not consistent. Glomerular hypertrophy is a characteristic finding of DN, but it does not seem to develop in all glomeruli concurrently. I hypothesized that differential gene expression might occur depending on glomerular size, and that the differences in glomerular size as a result of diverse isolation techniques could lead to apparent discordance of gene expression. In this study, I investigated the differences in nephrin expression between small and large (hypertrophied) glomeruli isolated from diabetic rats. I focused on the expression of nephrin, the most important filtration barrier-associated molecule, due to the conflicting reports on its expression patterns in early diabetic nephropathy.Methods: To investigate the differences in nephrin expression according to glomerular size, glomeruli were isolated from 10 control (C) and 10 streptozotocin-induced diabetic rats (DM) at 6-weeks after the induction of diabetes by a sieving technique using sieves with pore sizes of 250 ㎛, 150 ㎛, 125 ㎛, and 75 ㎛. We then classified glomeruli into large glomeruli (on the 125 ㎛ sieve, LG) and small glomeruli (on the 75 ㎛ sieves, SG) groups. Glomerular volume was determined using an image analyzer, and mRNA and protein expression by real time-PCR and Western blot, respectively.Results: The mean volumes of the DM-LG (1.68 ± 0.08 x 106 ㎛3) and C-LG (1.47 ± 0.09 x 106 ㎛3) were significantly higher than those of the DM-SG (1.08 ± 0.04 x 106 ㎛3) and C-SG (0.97 ± 0.03 x 106 ㎛3) (p<0.01). Nephrin mRNA expression was significantly reduced in DM-LG (0.49 ± 0.10) compared to DM-SG (1.71 ± 0.21) and C glomeruli (C-SG, reference value 1; C-LG, 1.05 ± 0.16) (p<0.05), whereas its expression was significantly higher in DM-SG compared to DM-LG and C glomeruli (p<0.05). In contrast, there was no statistically significant difference in glomerular 18s mRNA expression among the four groups. Glomerular nephrin, both extracellular and intracellular, protein expression was increased in DM-SG, whereas there was a significant reduction in nephrin protein expression in DM-LG compared to C-SG and C-LG, as shown by nephrin mRNA expression. Densitometric quantitation revealed 56% and 92% increases in extracellular and intracellular nephrin protein expression, respectively, in DM-SG compared to C-SG (p<0.05). In contrast, extracellular and intracellular nephrin protein expression was decreased by 77% and 86%, respectively, in DM-LG versus C-SG (p<0.05). There was no significant difference in nephrin protein expression between C-LG and C-SG. WT-1 and β-actin protein expression were similar among the four groups.Conclusion: These data suggest that the nephrin gene is differentially expressed according to glomerular size. Furthermore, hypertrophied glomeruli with lesser nephrin expression may be responsible for albuminuria in the early stage of DN.