Mesenchymal stem cells with calreticulin gene modulate cell adhesiveness through an integrin-mediated mechanism

Abstract

[한글]성인 골수에서 유래된 중간엽 줄기 세포(MSC)의 이식은 심근의 손상에 따르는 심근 재생 치료에 대한 잠재력을 가진다. 그러나, 이식 후 세포/기질 상호반응의 손실에 의한 세포 사멸인 anoikis에 의한 낮은 세포의 생존성은 생체 내에서 이 세포들의 재생 능력을 제한한다. 접착력은 MSC의 분화에 대한 주요한 인자로 알려져 있다. 이 연구에서, 우리는 심근 기질과 생존성에 대한 접착력을 강화하기 위해 생체 외에서 Calreticulin (CRT)로 쥐의 중간엽 줄기 세포를 유전적으로 조작하였다. 우리는 2주간의 배양 후 섬유아세포의 표현형을 가진 군체를 형성한 MSC를 사용하였고 이것은 95%이상의 CD71의 발현을 보인다. CRT를 도입한 MSC는 대조군 MSC보다 8배 이상의 CRT 발현을 보인다. 양적인 부착 실험은 CRT 도입은 fibronectin에 대한 MSC의 부착을 증가시킴을 보여준다. 유사하게도 CRT를 도입한 MSC의 확장과 이동은 동일함 방법으로 증가된다. 한편, CRT siRNA를 도입한 CRT의 하위 조절은 fibronectin에 대한 MSC의 부착과 확산을 상당히 저해한다. 이처럼, CRT의 흡착 기능에 대한 저해는 fibronectin에서 MSC의 이동을 상당히 저해한다. Fibronectin에서 CRT를 도입한 MSC는 단지 MSC 자체와 비교해서 부착에 관련된 유전자들인 FAK와 Src의 상당한 인산화의 증가를 보인다. PI3K의 인산화는 또한 CRT를 도입한 MSC에서 증가한다. LAD 결찰법을 사용한 쥐의 심근 손상의 유도 1주일 후에 4’,6-diamino-2-phenylinodole (DAPI)로 표지 된 MSC를 삽입한다. 1주일 후에 CRT가 도입된 MSC의 생존율은 대조군 MSC보다 30%가량 높고 전자에서 삽입된 세포의 이동은 강화된다. 우리의 연구는 CRT로 도입된 MSC는 확산과 이동뿐만 아니라 기질로의 세포 부착을 강화하고 또한 생체 외에서 부착 복합체의 결합을 강화함을 보여준다. 이 결과들은 심근 손상과 말기 심부전의 치료에 대한 새로운 치료 원리로서 도입 전에 치료목적의 유전자로 MSC를 조작할 수 있음을 보여준다.

[영문]Transplantation of adult bone marrow-derived mesenchymal stem cell (MSC) has the potential to treat the cardiac repair following myocardial injury. However, poor cell viability due to anoikis, cell death induced by the loss of cell/matrix interaction, after transplantation has limited the regenerative capacity of these cells in vivo. It is known that adhesion is a key factor for the differentiation of MSCs. In this study, we genetically modified rat mesenchymal stem cells with calreticulin (CRT) ex vivo to enhance the adhesiveness to the cardiac matrix and survival in the last. We used MSCs formed colonies with fibroblast-like morphology after 2 weeks culture, which was expressed CD71 over 95%. CRT-transfected MSCs expressed over 8-fold higher of CRT than non-transfected control MSCs. Quantitative adhesion experiments demonstrated that CRT transfection increased adhesion of MSCs to fibronectin. Similarly, spreading and migration of CRT-transfected MSCs were increased at the same manner. On the other hand, down-regulation of CRT by transfection of CRT-siRNA significantly decreases adhesion and spreading of MSCs on fibronectin. Likewise, interfering with the adhesive function of CRT markedly reduces migration of MSCs on fibronectin. CRT transfected MSCs on fibronectin displayed a significantly increase phosphorylation of focal adhesion related genes, FAK and Src, compared to MSCs only. Phosphorylation of PI3K was also increased in CRT transfected MSCs. One week after induction of rat myocardial infarction using LAD ligation, MSCs labeled with 4’,6-diamino-2-phenylindole (DAPI) were implanted. After 1 week, survival of CRT-transfected MSCs was 30% higher than that of control MSCs and in the former, migration of implanted cells was enhanced. Our studies indicate that CRT-transfected MSCs enhance cell adhesiveness into a matrix as well as spreading and migration and also enhance the assembly of focal adhesion complexes in vitro. These data may provide genetic modification of MSCs with a therapeutic gene before transplantation as novel therapeutic rationales for the treatment of myocardial infarction and end-stage cardiac failure.