대장암 마우스모델에서 신규 CpG 올리고핵산(CpG oligodeoxynucleotide)을 이용한 면역치료 효과

Abstract

[한글]대장암의 근본치료는 수술적 절제이나 전체 환자의 25%가 이미 진단 당시 원격 전이되어 있고 전체 환자의 40%가 결국 재발된다. 현재까지 대장암의 치료약제로는 항암화학요법, 생물학적 표적치료가 알려져 있으나 최적의 치료 방법은 아직 정립되지 않았고 또한, 화학요법은 심각한 독성 때문에 환자의 골수기능과 면역 기능을 저해 시키는 부작용을 가지고 있다. 면역치료는 최근 비교적 적은 독성과 종양에 대항할 수 있도록 면역세포의 활성화 작용을 통하여 치료하는 매우 유망한 첨단 치료방법으로 각광을 받고 있다. 이러한 면역치료의 핵심기술 중 하나는 면역학적 어쥬반트(Adjuvant)의 개발이 필수적이다. 이 중 유망한 면역 어쥬반트의 하나로 Toll like receptor (TLR) 9을 조절하는 리간드인(ligand)인 CpG ODN (CpG ODN; Oligodeoxynucleotide)가 최근 주목을 받고 있다. CpG ODN은 선천면역의 감지수용체인 TLR9과 특이 결합하여 세포내부로 면역신호전달을 촉발하며 이차적으로 다양한 선천면역세포 및 적응면역세포를 자극한다. 그러므로 항종양효과 및 T 세포 및 B 세포의 활성화로 인한 보호항체생성 및 세포독성 특이 림프구의 활성을 유도하는 강력한 항종양효과를 나타낸다. CpG ODN의 대장암에서의 효과는 아직 전임상수준으로 그 기전과 다양한 합성CpG ODN의 비교연구가 매우 미흡하다. 본 연구의 목적은 대장암의 치료제 후보물질로서 CpG ODN을 이용하여 대장암의 종양억제 효과와 생존율을 관찰하고 신규 개발된 CpG ODN (HK-13)을 활용하여 종양억제 능력과 그 치료 기전을 밝히고자 하였다. 재료 및 방법으로 CT-26 마우스 대장종양 세포주를 이식한 BALB/c 마우스에서 CpG ODN에 의한 종양성장억제와 마우스의 생존율을 분석하였다. 또한, 종양억제 기전을 알아보고자 CpG ODN에 의한 자극 후 세포 증식과 자연살해세포의 살상능력 등 면역세포 활성을 관찰하였다. 마지막으로 이러한 활성화에 선천면역의 관련성을 알아보기 위해 종양이 이식된 마우스에서 자극된 복강 내 대식세포와 비장세포를 분리하여 Th 1 (T helper 1) 형태의 cytokine 발현을 역전사 중합효소연쇄반응으로 확인하여 다음의 결과를 얻었다.1. CT-26 세포주 대장암 이식 마우스에서 신규 합성 인간형 CpG ODN은 BALB/c 마우스에서 기존의 마우스형 CpG ODN과 유사하거나 보다 우수한 종양 성장억제효과와 생존율을 보였다.2. 신규 인간형 CpG ODN으로 치료한 마우스 중 장기 생존한 마우스에서 CT-26세포를 재이식 후에도 생존하여 기억면역을 유발한 것으로 사료되었다.3. 신규형 CpG ODN으로 치료한 마우스대식세포에서 TNF-α, IL-6, IL-12 mRNA가 발현되었고 비장에서는 IFN-γ mRNA 등이 발현되어 Th1 형의 cytokine의 발현을 관찰하였다.4. 신규형 CpG ODN처리시 우수한 비장세포의 증식능과 자연살해세포의 살상 능력이 있었다.5. 대장종양을 이식한 마우스에서 신규 인간형 CpG ODN은 마우스형 CpG ODN과 대등하거나 우수한 면역반응이 증명되었다.결론적으로 대장암 마우스이식 모델에서 신규 인간형 CpG ODN 치료는 매우 효과적이며 이는 선천면역세포의 직접적인 활성화와 Th1 형태의 cytokine을 매개로 하는 면역 활성 효과로 사료된다.

[영문]TLR 9 (Toll like receptor 9) agonist is potent innate immune booster. As a prototype of TLR9 ligand, synthetic oligodeoxynucleotides (ODN) holding unmethylated deoxycytosine-deoxyguanosine (CpG) motifs has been entered immunotherapeutic clinical trial against infection (i.e, hepatitis B, C), tumor or asthma. In particular, the clinical application of CpG ODN as anti-cancer immunotherapeutics has been limited in several types of cancer such as lymphoma, lung cancer. Colorectal carcinoma is one of the most common malignancies in the Western world. Despite intensive research and the introduction of new therapies, the prognosis of colorectal cancer is still static. Moreover, CpG ODN based immunotherapy in patients with advanced colorectal cancer has not been conducted. As a preclinical test toward clinical trial, we attempted the immunotherapeutic impact of novel CpG ODN in the CT26 murine colon cancer model. To dissect the therapeutic potential novel CpG ODN, in vitro and in vivo immune parameters are employed.The results were as briefly synopsed:1. Novel CpG (HK-13) ODN peritumoral injection on flank-formed CT-26 tumor clearly reduces tumor volume. Histologically, there were seen infiltration of macrophage, polymorphonulclear cells into the tumor tissue receiving CpG ODN injection.2. Novel CpG ODN therapy in CT-26 intraperitoneal tumor model significantly prolonged the life span of tumor bearing BALB/c mice and, the rechallenge of CT-26 on the cured mouse verified complete protection against CT-26, suggesting that novel CpG ODN elicits a potent memory response.3. In vitro treatment of novel CpG ODN on mouse peritoneal macrophages upregulated the mRNA expression of Th1 cytokine.4. Consistently, novel CpG ODN treatment on BALB/c or C57BL/6 splenocytes induced IL-12, IL-6 release.5. As effector cell response, novel CpG ODN provoked a definite in vitro proliferation of naive splenocytes at 48hr incubation and potently augmented natural killer cell cytotoxicity against YAC1 cell. In summary, novel CpG ODN as mono-immunotherapeutics is effective in CT-26 murine colon cancer model. This therapeutic effect might be mediated by strong Th1 type immune augmentation.