결핵균 K 균주 유래항원을 이용한 면역진단 유용성 분석

Abstract

[한글]결핵은 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)에 의하여 유발되는 만성 감염성 질환으로 WHO의 보고에 의하면 세계 인구의 3분의 1이 결핵균에 감염되어 있는 전 세계적으로 주요한 질병 중 하나이다. 우리나라의 경우 매년 3만 명 이상의 새 환자가 보고되고 있으며, 3,000여명이 결핵으로 사망하고 있는 실정이다. 현재 사용되는 진단법은 민감도가 낮거나 균 배양에 긴 시간이 소요되는 등의 단점이 존재하므로 보다 간편하고 빠른 혈청진단이 널리 이용될 수 있는 가능성을 지닌다.본 연구에서는 현재 혈청진단에 이용되고 있는 주요 결핵 항원인 38 kDa, 16 kDa 등을 이용한 검사법보다 우월한 검사법을 개발하고자 국내에서 높은 빈도로 발견되는 결핵균 K 균주에서 아직 그 기능이 밝혀지지 않은 Rv1899c, Rv2407, Rv0652, Rv3369, Rv3648c 항원들의 혈청 진단 유용성을 조사하고자 하였다. 이를 위하여 H37Rv 표준 균주와의 유전체분석으로 ORF 내에 아미노산이 삽입된 Rv1899c, Rv2407와 H37Rv 표준 균주보다 많이 발견되는 단백질 Rv0652, Rv3369, Rv3648c 등을 연구 대상 유전자로 하여 대장균 내에서 발현시킨 후, Ni-NTA affinity chromatography로 정제하였다. 이들 새로운 유전자 재조합 항원들과 주요 결핵 항원인 38 kDa와 16 kDa을 대상으로 결핵 환자군 196명과 건강 대조군 147명의 혈청에서 ELISA를 이용하여 IgG 항체를 검출하였다. 결핵 환자 196명 중 185명에서 최소 한 개 이상의 유전자 재조합 항원에 대한 항체가 검출되었다. Rv0652 단백질은 결핵 환자군의 혈청에서 뿐만 아니라 건강 대조군 혈청에서 모두 높은 양성반응을 보여 면역진단항원으로서 유용성을 기대하기 어려웠다. Rv3369 단백질은 결핵 환자의 혈청에서 낮은 양성 반응을 보여 역시 혈청 진단의 항원으로서 평가할 수 없었다. Rv1899c, Rv2407, Rv3648c 항원은 각각 40.8%, 56.5%, 30.6%의 민감도와 71.4%, 69.3%, 76.6%의 특이도를 나타내었다.본 연구에서는 특이도 저하를 최소화 시키고 민감도를 향상시키기 위하여 K 균주의 유전자 재조합 항원들의 특이도를 90%가 되도록 양성 기준을 정하였다. 38 kDa 단독 사용 시 79.2%의 민감도로 41명의 환자를 검출해내지 못하였는데 16 kDa와의 조합으로 84.1%, Rv1899c와의 조합으로 87.3%, 그리고 Rv2407, Rv3648c와 조합할 경우 각각 85.7%, 85.7%로 총 20명의 환자를 더 검출하여 민감도가 상승하였음을 알 수 있었다. 또한 결핵 주요 항원인 38 kDa와 16 kDa의 조합으로도 검출해낼 수 없었던 20명의 환자 중 10명은 K 균주의 항원인 Rv1899c, Rv2407, Rv3648c의 조합만으로 검출할 수 있었다.본 연구 결과는 Rv1899c, Rv2407, Rv3648c의 K 균주의 유전자 재조합 항원들이 혈청진단에 유용한 단백질임을 제시하고 있으며, 다양한 결핵균 항원과의 조합으로 민감도가 향상되어 신속하고 저렴한 결핵의 혈청 진단법으로 유용할 것으로 기대된다.

[영문]Tuberculosis (TB), a chronic infectious disease caused by Mycobacterium tuberculosis, is one of the major public health problems in the world. In Korea, there have been over 30,000 new TB patients and approximately 3,000 deaths each year. For effective control of TB, early detection of TB is essential. However, the current diagnostic methods have some limitations such as low sensitivity for sputum smear microscopy and long turn over time for culture. Therefore, there have been numerous efforts to develop serological screening tests that are simple, rapid, and inexpensive.In this study, to identify antigens that would improve the accuracy of serological diagnosis of active tuberculosis, the genes encoding five potential proteins were selected based on proteomic and sequence analysis of M. tuberculosis K strain, the most prevalent strain in Korea. Rv1899c and Rv2407 in the K genome have amino acid insertion compared to those of the H37Rv genome, and Rv0652, Rv3369, Rv3648c proteins were more abundant in culture filtrate of K strain than that of the H37Rv strain. Each gene was cloned from the K strain genome, expressed in E. coli using T7 expression system, and its protein was purified by Ni-NTA affinity chromatography. In addition, 38 kDa and 16 kDa antigens that had been widely used in serological tests were also included in this study.ELISA was then employed to examine each protein for its reactivity with sera from in sera from 196 active tuberculosis patients and 100 healthy controls. Of the 196 TB patients, 185 (94.4%) had a significant level of IgG antibodies to at least one of these antigens. When cut-off was determined by adding 2 s.d. to the mean absorbance of health controls, sensitivity of Rv1899c, Rv2407, and Rv3648c proteins were 40.8%, 56.5%, and 30.6%, respectively, and specificity was 71.4%, 69.3%, and 76.6%, respectively. The Rv0652 protein was not useful due to low specificity and Rv3369 due to low sensitivity, respectively.As expected, the 38 kDa protein gave the highest sensitivity of 79.2% and specificity of 97%. When both 38 kDa and 16 kDa antigens were used, sensitivity reached 84.1%. In order to find a combination of antigens giving the maximum sensitivity while maintaining relatively high specificity, cut-off for each antigen was newly determined to the level giving 90% specificity. With the new cut-off value, addition of Rv1899c to 38 kDa gave a sensitivity of 87.3%. Likewise, addition of Rv2407 or Rv3648 gave a sensitivity of 85.7%. Interestingly, of 20 sera that were negative to 38 kDa or 16 kDa, 10 (50%) gave a positive reaction to Rv1899c, Rv2407 or Rv3648.In conclusion, this study suggests that Rv1899c, Rv2407, and Rv3648c recombinant antigen of K strain may be useful for serodiagnostic tests, particularly if these antigens are combined with 38 kDa, the most widely-used antigen. It looks, therefore, promising to develop a rapid and inexpensive screening test for TB using a cocktail antigen.