Hypertonic stress as novel modulator of 1α,25(OH)2D3-induced osteoclastogenesis in osteoblast and osteoclast

Abstract

[한글]뼈개조는 뼈를 형성하는 뼈모세포 (osteoblast)와 뼈흡수를 유발하는 뼈파괴 세포(osteoclast)에 의해 조절된다. 뼈파괴세포분화과정에서 뼈모세포는 뼈파괴세포분화를 촉진하는 인자인 RANKL과 M-CSF를 분비하며, 이와 동시에 RANKL 대한 저해제인 OPG를 분비하여 뼈파괴세포분화를 조절한다. 뼈파괴세포에 의하여 뼈흡수가 일어나면, 분해산물로서 Ca2+ 이나 인산염 (PO42-), 아교질, osteopontin 등과 같은 뼈무기질과 뼈유기질이 증가하게 되어, 뼈모세포와 뼈파괴세포 주위에 삼투압이 높은 상태의 미세환경 (hyper- tonic microenvironment)을 유발된다. 이러한 고삼투압 환경자체가 뼈대사 조절에 영향을 미칠수 있을것으로 추측되며 본 실험에서는 높은 삼투압이 뼈파괴세포분화에 미치는 영향과 뼈대사에 미치는 영향을 분석하였다.뼈모세포와 큰대식세포를 혼합배양하여 10 nM의 1α,25-dihydroxy vitamin D3 (1α, 25(OH)2D3)을 투여하여 뼈파괴세포분화를 유도한 후, 삼투성 자극으로 sucrose를 농도별 (25, 50, 100, 150, 200 mM)로 처리하였다. TRAP 염색법을 이용하여 핵이 3개 이상으로 융합된 뼈파괴세포의 수를 측정한 결과, sucrose 농도가 증가함에 따라 뼈파괴세포의 수가 감소하였다. 이러한 뼈파괴세포수의 감소는 삼투성 자극으로 인한 결과라는 것을 확인하기 위하여 세포 독성능 검사를 수행한 결과, sucrose 50 mM 이하의 농도에서는 삼투성 자극으로 인한 세포의 독성은 나타나지 않는 것으로 확인하였다. 삼투성 자극으로 인하여 뼈파괴세포분화가 감소하는 기전을 규명하기 위하여 뼈모세포에서 뼈흡수 기전의 중요한 인자인 RANKL과 OPG의 mRNA 와 단백질 발현양을 역전사중합효소연쇄반응법 (RT-PCR)과 효소면역측정법 (ELISA)으로 측정하였다. 그 결과, 삼투성 자극의 농도가 증가함에 따라 RANKL mRNA와 단백질 발현양이 모두 감소하였으나 OPG mRNA와 단백질의 발현양은 변화가 없었다. RANKL 발현은 1α, 25(OH)2D3으로 유도되는 세포내 칼슘 유입이 발생되면서 시작되는데, 이때 삼투성 자극을 투여하게 되면 세포내 칼슘 유입이 일어나지 않는다. 또한, 세포내 칼슘 유입으로 인한 CaMKII의 발현은 삼투성 자극에 의하여 억제되었다. 이는 삼투성 자극이 뼈모세포에서 1α, 25(OH)2D3으로 유도되는 세포내 칼슘유입을 막아 CaMKII의 발현을 억제하고, 이로 인하여 RANKL 발현을 감소시켜 뼈파괴세포분화를 억제한다고 생각할 수 있다.또한, 삼투성 자극은 RANKL로 인하여 유도되는 뼈파괴세포분화과정에서도 뼈파괴세포의 수를 감소시켰다. 본 실험에서는 그원인이 RANKL에 의해 시작되는 뼈파괴세포 분화과정에서 필수적 전사인자의 발현이 억제되었기 때문일 것이라 예상하였다. 이에 뼈파괴세포 분화인자인 JNK, ERK, p38, 그리고 NF-κB를 면역검색법(western blotting)으로 발현양을 측정하였다. 그 결과, 삼투성 자극에 의하여 분화인자인 JNK, ERK, p38, 그리고 NF-κB 발현양이 감소하였다. 또한 최근 뼈파괴세포분화의 결정적 인자라고 알려진 NFATc1의 발현양 또한 삼투성 자극으로 인하여 감소하였다. 특히 NFATc1은 RANKL 자극 후 24시간 뒤에 발생되는 Ca2+ oscillation과 밀접한 연관성이 있는 것으로 알려져 있으며, 삼투성 자극은 이러한 Ca2+ oscillation을 억제하였다. 이러한 결과는 삼투성 자극이 RANKL에 의해 유도되는 Ca2+ oscillation을 억제하며, 이로 인한 NFATc1 발현의 억제로 인하여 뼈파괴세포분화를 억제하는 것으로 이해할 수 있다.이상의 사실로 미루어 삼투성 자극에 의하여 감소된 뼈파괴세포분화는 뼈모세포에서 RANKL 발현의 감소와, 대식세포에서 뼈파괴세포분화인자인 NFATc1의 발현 감소로 인한 복합적인 원인에 의하여 발생되는 결과로 해석된다. 따라서 삼투성 자극은 뼈파괴를 조절할 수 있는 새로운 뼈대사 조절인자로서 뼈대사 기전에서 중요한 요소로 작용할 것으로 예상된다.

[영문]The bone remodeling is dependent on the balance between bone-forming osteoblasts and bone-resorbing osteoclasts. During the bone resorption, activated osteoclasts induce extracellular Ca2+/PO42- concentration to reach up to 40mM and degrade organic materials in the extracellular fluid around bone cells. In preliminary experiment, it was found that the hypertonic osmolality inhibited 1α, 25(OH)2D3-induced osteoclastogenesis using TRAP staining. In hypertonic conditions, the expression of RANKL and its mRNA were decreased in dose-dependent manner, but no change of the expression of OPG and M-CSF was seen using RT-PCR and ELISA assay. To demonstrate the effect of hypertonic osmolality on bone metabolism at the molecular level. This study investigated Ca2+-regulated signaling and the change of intracellular Ca2+ concentration by hypertonic stress. Hypertonicity decreased the expression of calmodulin-sensitive protein kinase (CaMKⅡ, Ⅳ) with dependent manner of the activity of L-type VSCCs and inhibited increase of intracellular Ca2+ concentration in the osteoblast. To know the mechanism of how RANKL specifically effects on oteoclast differentiation in hypertonic condition, we took screening approach to RANKL signal molecules including MAPK(ERK, JNK, p38), NF-κB, and NFATc1. The results show that hypertonic osmolaliry blocked the activation of MAPK activity, and NF-κB. Also hypertonic osmolaliry inhibited NFATc1 expression and RANKL-induced Ca2+ ocillation in BMMs. Conclusively, hypertonic osmolaliry inhibited RANKL expression via decrease of CaMKⅡ activity in osteoblast and blocked the activation of MAPK, NF-κB, and NFATc1 in RANKL-induced osteoclast differentiation signaling. The decrease of RANKL-induced Ca2+ ocillation by hypertonic stress induced the inhibition of NFATc1. Hypertonic osmolaliry may be a novel candidate for the regulation of bone metabolism through bone resorption.