Identification and characterization of a pancreatic cancer related novel gene from oligonucleotide microarray analyses

Abstract

[한글]췌장암은 1년 생존율이 10%에 불과하며, 인체에 발생하는 다양한 암 중에서 가장 예후가 불량하다. 국내에서도 최근 10년간 2배의 발생율 급증을 보이고 있다. 암으로의 변형에는 여러 유전자들이 관여하기 때문에 세포 전체에 걸친 유전자의 발현을 확인하는 것이 중요하게 인식되고 있으며, 세포내의 상황을 종합적으로 파악하기 위한 microarray, proteomics와 같은 high-through put method가 널리 사용되고 있다. 췌장암의 경우, 발현 변화를 보이는 전체 유전자 중, 미지의 유전자 조각(EST)이 차지하는 비율이 다른 암에 비해 월등히 크다고 알려져 있으며, 이는 췌장암의 원인, 성장 및 전이에 관여하는 주된 인자들이 더 다양하고 복잡함을 시사하며, 따라서, 관련 EST의 규명이 췌장암의 전반적인 생물학적 이해에 필수적이라 볼 수 있다. 본 연구는 췌장암 환자들의 유전자 발현패턴을 oligonucleotide microarray 분석을 통해 얻어진 data 중에서, EST에만 초점을 맞춰, 췌장암에 관련된 EST로부터, 신규 유전자를 발굴하고, 췌장암 발생 및 전이 등에 미치는 역할을 비롯한 생물학적 기능을 규명하려 하였다. 본 연구에서 수술로 절제된 정상조직/암조직으로부터의 RNA와 Affymetrix GeneChip을 이용하여 oligonucleotide microarray를 시행하였다. Microarray raw data를 MatLab 통계처리 프로그램으로 p-value와 fold change 등을 계산함으로써, 유전자 발현 양상을 분석하였다. 약 5866개의 유전자가 정상 췌장조직에 비해 췌장암에서 과(過)발현 되었으며 (P < 0.05, Fold change > 1.2), 그 중 EST 조각이 9% (532개)를 차지하였다. 532개의 EST와, 췌장암 세포주에서 과발현된다고 알려진 EST 조각의 공개돤 정보를 비교하여, 염기서열이 일치하는 50개의 조각을 선별하였으며, 이들 중 p-value가 0.001 이하이면서 발현양이 암조직에서 2배 내지 3배 증가하는 EST 조각을 다시 선별하여, 이들의 full length cDNA cloning을 실시하였다. 가장 먼저 full length cloning이 완성된 EST들 중, 302라 명명한 신규 유전자를 확보하였으며, public database와 생물정보학을 동원하여 유전자를 분석한 결과, hypothetical 302 protein은 핵 내에 존재하고, transcription regulation에 관여할 가능성이 높았다. 302 발현의 변화가 암화 과정의 마지막 산물일 가능성도 배제할 수는 없지만, 302가 전사조절 인자라면, 그에 의해 조절되는 하위 유전자에 의한 종양의 형성 또는 발달 가능성을 염두에 두고 후속 실험을 진행하였다. 먼저, 8종류의 췌장암 세포주를 비롯, 위암 세포주에서의 302 mRNA 발현을 RT-PCR로 확인하였다. NIH3T3 cell을 이용하여, 세포내 유전자 도입하였을 때, 암 관련 세포 형질 변화가 확인되었고, nude mice를 이용한 동물 모델에서도 302를 과발현하는 NIH3T3가 종양을 형성함을 확인하였다. 한편, NIH3T3 cell에서 ErbB1, WDR39, SARS 등의 유전자들이 302에 의해 발현 조절됨을 확인하였다. 그러나, microarray 기법 등을 동원하여, 유전체 전반의 발현 변화를 조사하면, 302에 의한 더 많은 하위 조절 인자들이 밝혀질 것으로 추측되며, 이들의 상호 작용 예측을 통해 302 자체의 기능 규명에 도움이 될 것이다.이와 같은 결과를 종합해 볼 때, 302는 전사조절 인자로서, 암으로 변형시키는 활성을 가진 신규 oncogene일 가능성과, 인간암의 발암, 발달, 전이 과정에 있어서 결정적 역할을 수행할 가능성도 높다 사료된다. 하지만, 302의 명확한 생물학적 기능을 규명하기 위해서는, 302 발현을 조절하는 상위 기전과 302에 의해 조절되는 하위 유전자들에 대한 심층 연구가 더 진행되어야 할 것이며, 생쥐 fibroblast cell 뿐만 아니라, 인간 세포에서 302 과발현에 의한 형질 변화 또한 확인되어야 할 것이다. 한편, 유전자기능 분석의 일환으로 형질전환 동물 모델의 수립은 암 연구에 있어서 암유전자 또는 억제암유전자의 기능 연구를 위한 가장 기본적이면서도 최종단계의 생체 실험이고, 적절한 동물모델 없이는 해당 유전자 기능 규명을 위한 근원적인 접근이 불가능함을 감안하면, 향후, 302를 이용한 형질 전환 생쥐 동물 모델의 수립이 필요하리라 사료된다.특히, 췌장암의 경우, 현재까지 주목할 만한 동물 모델이 없기 때문에, 발암 과정의 이해와 조기 진단이 거의 불가능한 상황임을 고려할 때, 본 연구에서 발굴된 302로부터 형질 전환 생쥐 동물 모델을 통해, 인간의 암과 유사한 췌장암 동물모델이 개발된다면, 향후 췌장암 종양발생/발달의 기전 규명에 중요한 단초를 제공할 수 있으리라 사료된다.

[영문]Global changes in gene expression profiles between tumor and normal tissues were examined to identify differentially regulated genes in the pancreatic adenocarcinoma. A cancer-upregulated gene, 302, was identified as an EST (expressed sequence tag) exhibiting significantly differential expression in human pancreatic cancer tissues. Hypothetical protein, 302, showed weak homology with DR1, a human transcriptional repressor, and EGFP-fused 302 protein was predominantly localized in the nucleus. Mouse fibroblasts overexpressing 302 exhibited distinct cancer-specific phenotypes in vitro and generated tumors in nude mice which were comparable to those resulting from a well-known oncogene, H-ras. Genes such as ErbB1, WDR30, sdhB and SARS were upregulated in mRNA level in NIH3T3 overexpressing 302. Altogether, 302 is a newly identified tumor-associated gene which possesses highly oncogenic activities; this gene possibly belongs to one of the transcription regulator families which is strongly involved in tumor biogenesis.