IL-12 및 IL-18을 발현하는 종양 선택적 살상 아데노바이러스의 종양 성장 억제 효과

Abstract

[한글]암에 대한 면역 치료법은 부작용이 심각한 기존의 방사선 요법 , 항암화학 요법과는 달리 우리 몸의 면역 체계를 활성화시킴으로서 암 세포만을 특이적으로 제거하는데 그 목적이 있다. 하지만, 암 세포들은 여러 가지 전략을 사용하여 면역 체계를 교묘히 피해가며, 설사 면역 체계가 활성화 되었더라도 활성화된 항종양 면역 반응으로부터 도피할 수 있는 능력 또한 갖고 있기 때문에 항암 면역 치료에 많은 한계를 드러내고 있다. 따라서 이와 같이 면역원성이 지극히 낮은 암 세포에 면역원성을 부여함으로서 면역 감시 체계에 암 세포를 노출시켜 항종양 면역 반응을 유도하는 것이 관건이라 할 수 있겠다.따라서 본 연구에서는, 종양 특이적 살상 아데노바이러스인 Ad-ΔB7에 항암 면역반응을 유도할 수 있는 IL-12와 IL-18 유전자를 도입하여 Ad-ΔB7-IL12, Ad-ΔB7-IL18, 그리고 Ad-ΔB7/IL12-IL18을 각각 제작하였다. C57BL/6 마우스의 B16-F10 흑색종 모델에서 항종양 효과를 검증한 결과, Ad-ΔB7-IL12 또는 Ad-ΔB7/IL12-IL18을 투여한 마우스에서는 종양의 성장이 억제되고 그 억제효과가 지속 되는 것을 관찰할 수 있었다. 또한, IL-12만 발현하는 Ad-ΔB7-IL12에 비해 IL-12와 IL-18을 동시에 발현하는 Ad-ΔB7/IL12-IL18을 투여한 경우에 더욱 현저한 항종양 효과가 유도되었다. 생체내 생존율 검증 실험에서 역시 Ad-ΔB7/IL12-IL18 군이 가장 높은 생존율을 나타냈다. 또한, Ad-ΔB7/IL12-IL18 군의 마우스의 비장에서 CD4+, CD8+ T 세포의 군집을 조사 한 결과, 다른 대조군에 비하여 유의하게 증가 된 것을 확인 할 수 있었으며, IFN-γ ELISpot과 cytotoxic T lymphocyte(CTL) assay를 시행한 결과, Ad-ΔB7/IL12-IL18에 의해 암세포 특이적인 CD4+, CD8+ T 세포가 증가되어 Type-1 면역 반응이 유도됨으로서 항종양 효과가 증대되었음을 알 수 있었다. 아울러, PBS와 Ad-ΔB7 대조군에 비하여 Ad-ΔB7/IL12-IL18 군에서 종양조직의 괴사가 현저하게 관찰되었을 뿐만 아니라 종양조직내로의 림프구의 침윤이 확연히 증가된 것을 관찰할 수 있었다. 따라서 침윤된 림프구의 세포군들을 면역 조직 화학 염색법(immunohistochemistry, IHC)을 통하여 알아본 결과, Ad-ΔB7/IL12-IL18 군에서 현저히 증가된 CD4+와 CD8+ T 세포군들을 관찰할 수 있었다. 또한, Ad-ΔB7/IL12-IL18을 투여한 마우스의 종양 조직 내에서 IL-12, IL-18 그리고 IFN-γ의 발현을 확인 할 수 있었다. 이러한 결과들은 암세포 특이적으로 복제되어 암세포 살상을 유도하는 Ad-ΔB7/IL12-IL18이 종양 내에서 활발히 증식함으로서 바이러스 내에 삽입되어있는 IL-12와 IL-18이 종양내부에서 발현되어 결과적으로는 암세포 특이적인 CD4+, CD8+ T 세포가 종양 조직 내로 침윤하고, 이들로부터 IFN-γ의 발현이 유도됨으로서 항종양 효과를 유도하는 것으로 생각되어진다.결과적으로, 본 연구에서 제작된 Ad-ΔB7/IL12-IL18은 종양 선택적 아데노바이러스인 Ad-ΔB7에 의해 유도되어지는 종양 세포 특이적 항종양 효과뿐만 아니라, IL-12와 IL-18의 종양 세포 특이적 고 발현에 따른 항종양 면역반응을 동시에 유도함으로서 한 층 더 증대 된 종양 세포 특이적 항종양 효과를 유도할 수 있었다. 이는 기존의 방사선 요법 , 항암화학 요법에서 나타나는 심각한 부작용을 최소화 할 수 있을 것으로 예상되며, 아울러 항암 면역반응으로 국소적인 암의 치료는 물론 암의 재발 억제 및 전이 암의 치료에도 유용하게 이용 될 수 있을 것으로 사료된다.

[영문]Cancer immunotherapy denotes a strategy for activating a host''s immune response for the treatment of malignancy. Although cancer cells are less immunogenic, immune system is capable of recognizing and eliminating cancer cells. Oncolytic adenoviral vectors are currently being developed as biologic anti-tumor agents, and coupling the lytic function of an oncolytic adenovirus with its ability as a transgene delivery system represents a powerful extension of this methodology. IL-12 is reported to exhibit potent anti-tumor effect by promoting NK cell and cytotoxic T cell activities. IL-18 is also have shown that augments cytotoxicity of NK cells and proliferation of T cells. It stimulates Th1 cells to produce IL-2 and IFN-γ. This effect augmented in a synergistic manner IL-12. To increase the potential anti-tumor effect of the oncolytic adenovirus, we have generated an E1B deleted and E1A mutated oncolytic adenoviruses, Ad-ΔB7-IL12, Ad-ΔB7-IL18, or Ad-ΔB7/IL12-IL18 that expresses IL-12, IL-18, or IL-12 plus IL-18, respectively. The therapeutic efficacy of these oncolytic adenoviruses was then evaluated in immunocompetent C57BL/6 mice bearing murine melanoma B16-F10 tumor. The results showed significant inhibition of tumor growth following Ad-ΔB7/IL12-IL18 treatment compared to Ad-ΔB7, Ad-ΔB7-IL18, or Ad-ΔB7-IL12 treated tumors. Moreover, the oncolytic adenovirus expressing both IL-12 and IL-18 demonstrated enhanced anti-tumor effect and higher incidences of complete tumor regression compared to Ad-ΔB7, Ad-ΔB7-IL18, or Ad-ΔB7-IL12. To establish that the observed anti-tumor effect is associated with the generation of a tumor-specific immune response, we examined the cytolytic activity by IFN-γ ELISpot assay and CTL assay. We observed that Ad-ΔB7/IL12-IL18 induced significantly higher T cell-mediated anti-tumor effect than its cognate controls, Ad-ΔB7, Ad-ΔB7-IL12, and Ad-ΔB7-IL18. Furthermore, immunohistochemical studies demonstrated robust CD4+ and CD8+ T-cell infiltration in these mice compared to the Ad-ΔB7, Ad-ΔB7-IL18, or Ad-ΔB7-IL12-treated subjects. These data indicate that oncolytic adenovirus-mediated IL-12 and IL-18 gene transfer provides a potential therapeutic strategy for the management of neoplasia.