Establishment of collagen gel-based co-culture models for invasive study with respect to cancer cell-fibroblast interaction

Abstract

[한글]상피와 결체 조직사이의 상호작용 (epithelial mesenchymal interaction, EMI)은 배아의 발육, 상처의 치유, 암의 발생에 있어서 중요하다. 본 실험에서 EMI에 초점을 맞추어 침윤성 성장 연구를 위하여 생체 조건과 가장 유사한 체외실험 모델을 디자인하였고 이 모델이 생체 조건과 유사하며 상피와 결체 조직간의 상호작용에 대한 연구에 적합하다는 것을 증명하고자 하였다.본 연구에서는 암세포로 두 종류의 구강 편평세포암종 세포주 YD-10B와 YD-38을 이용하였고, 섬유아세포로는 Swiss 3T3를 사용하였다. 우선 collagen gel을 이용한 입체배양을 하여 collagen gel에 섬유아세포 유무에 따른 침윤 효과를 관찰하였다. 상피와 결체조직사이의 상호작용에 대한 연구를 하기 위한 생체와 유사한 환경을 만들어 주기위해 다음과 같이 3종류의 모델을 고안하였다. Type I collagen gel을 이용하여 섬유아세포를 사용하지 않고 암세포를 입체 배양한 모델 (C), type I collagen gel으로 중간층을 만들어 섬유아세포와 암세포를 분리하여 입체 배양한 모델 (C-In), 섬유아세포가 포함된 type I collagen gel을 이용하여 배양한 모델 (C-Dr)로 진행하였다. 또한 섬유아세포와 암세포를 type I collagen 없이 혼합 배양한 모델과 transmembrane system을 이용하여 두 종류의 세포를 분리하여 배양한 모델과 비교하였다. 본 연구에서 제안된 모델이 유용한지를 알아보기 위해 암세포의 침윤과 전이에 중요한 역할을 하는 MMP-2와 MMP-9의 발현 및 활성도를 RT-PCR과 zymography로 분석하였으며, 실험에 사용된 두 종류의 세포주가 유래된 환자 조직에 대한 면역화학염색을 통하여 생체 조건과의 유사성과 암의 침윤과정에서 MMP-2와 MMP-9의 발현을 비교하였다.입체 배양에서 두 세포주는 섬유아세포가 collagen gel에 포함된 경우에만 침윤성 성장을 보였다. YD-38 세포주에 비하여 YD-10B 세포주가 더욱 뚜렷한 침윤성 성장을 보였다. C, C-In, C-Dr모델에서 암세포를 분리하여 MMP-2와 MMP-9 mRNA 발현을 본 결과 C-Dr 모델에서 MMP-2와 MMP-9의 발현증가를 보였다. 이와 마찬가지로 C, C-In, C-Dr모델에서 MMP-2와 MMP-9의 활성도를 비교한 결과에서도, C-Dr모델에서만 active form MMP-2가 발현되었다. 암세포와 섬유아세포의 혼합배양한 모델과 transmembrane system을 이용한 간접 배양 모델에서 MMP-2와 MMP-9의 활성도를 비교한 결과, 두 세포의 혼합배양 모델에서만 active form MMP-2가 발현됨으로서, C, C-In, C-Dr모델에서와 같은 연구 결과를 보였다. 두 종류의 암세포주가 유래한 환자 조직의 면역화학염색에서 MMP-2의 발현은 침윤하고 있는 암세포를 둘러싸고 있는 섬유아세포와 기질에서 강양성 반응을 보였다.이상의 연구결과에서 MMP-2의 활성도는 섬유아세포와 상피세포의 직접적인 접촉에 의해 활성화 되는 것을 알 수 있었다. 이 연구 결과는 혼합배양 모델과 collgen gel 이용한 모델에서 같은 결과를 보였고, 면역조직화학 염색에서도 이를 뒷받침하는 결과를 보였다. 이로서 제안된 실험모델이 상피와 결체 조직사이의 상호작용 연구를 위한 적절한 모델임을 확인하였다.

[영문]Epithelial and mesenchymal interaction(EMI) is well known to be essential in embryonic development, wound healing and carcinogenesis. This study was aimed to design in vitro model for the invasive study with respect to cancer cells and fibroblasts interaction.This study used two oral squamous cell carcinoma cell lines YD-10B and YD-38. To establish in vitro system for invasion study, three different models were designed; Collagen gel-based cancer cell culture model devoid of Swiss 3T3 fibroblasts (C), Collagen gel-based indirect co-culture model (C-In) with intervening collagen layer between cancer cells and collagen gel layer with Swiss 3T3 fibroblasts, and Collagen gel-based direct co-culture model (C-Dr). C-In and C-Dr models were compared with separate co-culture and mixed co-culture models using transmembrane system. To evaluate whether these models are appropriate for invasive study, the activity of matrix metalloproteases (MMP)-2 and MMP-9 was examined by gelatin RT-PCR and zymography because MMP family are well known to have an active role in cancer cell invasion and metastasis. Tissue from which YD-10B and YD-38 cell lines were established and used for immunohistochemical staining for the detection of MMP-2 and MMP-9.As results, MMP-2 mRNA was expressed in both YD-10B and YD-38 cell lines, when cultured in the collagen gel without fibroblasts. On the other hand, MMP-9 was expressed faintly in YD-10B cells and was not detected in YD-38 cells. Direct co-culture of cancer cells and Swiss 3T3 fibroblasts in the collagen gel showed remarkable increase of MMP-2 and MMP-9 expression. In indirectly contacted co-culture models, both MMP-2 and MMP-9 were not increased. Gelatin zymography showed that the active form of MMP-2 was induced only by C-Dr model and mixed co-culture, suggesting that MMP-2 activity can be induced by direct contact between cancer cells and fibroblasts. In immunohistochemical staining of MMP-2 expression, multiple foci of strong positive reaction were found in the interface between cancer cell nests and surrounding stroma at the invasive front in both cell lines. The cancer cells also showed MMP-2 positive reaction in two cell lines. In MMP-9 expression, YD-10B cells showed diffuse positive reaction throughout cancer cells and surrounding stroma. MMP-9 expression showed diffuse positive reaction in the stroma of YD-38 cancer tissue, while cancer cells of YD-38 showed focal positive reaction in the infiltrating area into bony tissue.From the results, MMP-2 may be activated by direct contact between cancer cells and fibroblasts, not by soluble factors generated by indirect co-culture of two kinds of cells. As the techniques to isolate cancer cells of this model, the established C-In, C-Dr model can be useful to investigate the invasion study with respect to cellular interaction between cancer cells and fibroblasts.