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흰 쥐 간 성상(이토)세포의 내향성 포타슘 전류 특성 및 배양에 따른 변화

Other Titles
 Characteristics of inward rectifier K+ currents of hepatic stellate (Ito) cells in rat and their changes following culture 
Authors
 이동현 
Issue Date
2006
Description
의학과/박사
Abstract
[한글]간 성상세포는 여러 병적 상황에서 아근섬유세포나 평활근세포와 유사한 형태로 전환함으로써 만성 간질환에서의 혈관저항 증가 및 간문맥 고혈압 형성에 관여하고 있음이 알려져 있다. 최근에는 이 과정에 막전압 의존성 칼슘통로의 발현 증가가 동반한다고 보고된 바 있으나, 막전압 조절에 중요한 역할을 담당하는 내향성 포타슘 통로의 발현 및 그 기능에 관해서는 아직 간 성상세포에서 규명된 바 없다. 따라서 본 실험에서는 흰 쥐 간에서 분리된 간 성상세포에서 활성화 과정에 따른 내향성 포타슘 통로의 발현 및 기능 변화를 실시간 역전사 연쇄중합반응 (real-time reverse transcription-polymerase chain reaction) 및 gramicidin- perforated patch clamp 방법 등을 이용하여 관찰하였다. 분리 배양된 간 성상 세포들은 desmin, glial fibrillary acidic protein(GFAP) 및 a-smooth muscle actin(a-SMA) 등의 면역염색에서 모두 양성을 나타내었으며, 간 성상세포의 활성화 지표로 알려진 a-SMA와 L-type 막전압 의존성 칼슘통로(Cav1.2)의 발현은 3주 배양기간 동안 크게 증가하였다. 간 성상세포에 발현된 내향성 포타슘 통로의 주 아형은 Kir2.1과 Kir6.1이었으며, sulfonylurea 수용체 중에서는 SUR2B가 주로 발현되어 있었다. 대부분의 내향성 포타슘 통로 발현은 배양 1주부터 현저히 감소한 상태로 유지되었으나, Kir6.1은 감소 후 점차 증가하였다. 반면 SUR2B는 분리 이후 증가된 상태로 유지되었다. Kir2.1과 Kir6.1의 발현 감소는 Western blotting으로도 확인할 수 있었다. 전기 생리적 실험을 통해 전압-전류 관계를 관찰한 결과 간 성상세포는 크게 내향성 전류가 잘 나타나는 세포군(1형)과 그렇지 않은 세포군(2형)으로 구별할 수 있었다. 내향성 전류는 바륨(100 uM) 투여에 의해 억제되었고, 세포 외액의 포타슘 농도 증가(140 mM)에 따라 크기 증가 및 역전전압의 변화를 초래하였다. 이러한 변화는 1형 세포에서 보다 분명하게 나타났다. 안정막전압을 비교한 결과 1형 세포(-31.1±2.2 mV; n=52)가 2형 세포(-13.0±0.4 mV; n=60)에 비해 큰 절대값을 나타내었으며, 바륨 민감성 전류의 크기와 막전압의 절대값은 비례 관계를 보였다(r2=0.75). 바륨(1 mM)의 투여는 1형(15.9±1.5 mV; n=16) 및 2형(5.1±0.4 mV; n=15) 세포에서 막전압의 탈분극을 초래하였다. 배양 기간 동안 내향성 전류 크기의 감소가 관찰되었으며, 이와 함께 1형 세포에서 안정막전압의 절대값이 감소하는 양상을 나타내었다. 한편 ATP 민감성 포타슘 통로(KATP, Kir6.X) 개방제 pinacidil(200 uM) 및 차단제 glibenclamide(10 uM)에 의해 내향성 전류가 증가 및 감소되었으며, 그 정도는 세포들 마다 차이가 있었다. 이상의 결과들을 통해 분리 배양된 간 성상세포는 주로 Kir2.1과 Kir6.1로 구성된 내향성 포타슘 통로를 발현하고 있으며, 이들은 간 성상 세포의 안정막전압 형성에 중요한 영향을 미치고 있음을 확인하였다.

[영문]Hepatic stellate cells (HSCs) can transform into activated phenotype such as myofibroblasts or smooth muscle cells under several pathologic conditions, which are involved in elevated intrahepatic vascular resistance and portal hypertension. Recently, it has been reported that the expression level of the voltage-dependent Ca2+ channel increases during this activation process. In the case of inward rectifier K+ channel, however, it has not yet been clearly identified whether its expression is increased or not in HSCs, which might play a key role in regulating the membrane potential. In this study, the expression and the function of the inward rectifier K+ channels in HSCs isolated from a rat liver were investigated during the culture period using a real-time reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and a gramicidin-perforated patch-clamp technique. The cultured HSCs generally immunostained positive for desmin, glial fibrillary acidic protein (GFAP), and a-smooth muscle actin (a-SMA). The expression levels of a-SMA and L-type voltage-dependent Ca2+ channel (CaV1.2), which are well known activation markers, increased significantly after a 3-week culture period. The dominant subtypes of the inward rectifier K+ channels expressed in the HSCs were Kir2.1 and Kir6.1, and that of the sulfonylurea receptors (SUR) was SUR2B. During the culture period, the expression of the most inward rectifier K+ channels decreased significantly from 1 week and remained at a reduced level with the exception of Kir6.1, which increased steadily after the initial decrease. In contrast, the expression level of SUR2B increased throughout the culture period. According to the current-voltage relationships, the HSCs could be classified into two subgroups: one type showing a relatively large inward-rectifying K+ current (type 1), and the other type not showing such a current (type 2). The inward currents were blocked by Ba2+ (100 uM) and enhanced by the high extracellular K+ concentration (140 mM), which also shifted the reversal potentials to a positive value. These changes were more prominent in the type 1 HSCs. The resting membrane potential of the type 1 and type 2 HSCs were -31.1±2.2 mV (n=52) and -13.0±0.4 mV (n=60), respectively. The amplitude of the Ba2+-sensitive current was correlated with the absolute value of the membrane potential (r2=0.75). Ba2+ (1 mM) depolarized the membrane potential by 15.9±1.5 mV (n=16) in the type 1 HSCs and by 5.1±0.4 mV (n=15) in the type 2 HSCs. Following the culture period, the amplitudes of the inward K+ currents decreased in the type 1 cells, and the resting membrane potential became depolarized. The inward K+ currents in the HSCs were increased by an opener of ATP-sensitive K+ channel (pinacidil, 200 uM) and decreased by a blocker (glibenclamide, 10 uM). However, the dynamic ranges of current modulation varied among the HSCs. Overall, cultured HSCs isolated from a rat liver expressed inward rectifier K+ channels, mainly Kir2.1 and Kir6.1, which may physiologically regulate the membrane potential in HSCs.
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1. College of Medicine (의과대학) > Others (기타) > 3. Dissertation
URI
https://ir.ymlib.yonsei.ac.kr/handle/22282913/122941
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