The effect of agmatine on murine cortical endothelial cells under ischemic injury

Abstract

[한글]

뇌 허혈 손상 시 뇌 미세혈관의 결합이 손상되고, 이에 따라서 혈관내피세포에 의해 지지되고 있는 뇌혈관장벽에 손상을 주게 된다. Extracellular matrix는 뇌 혈관장벽을 보존하는데 중요한 작용을 하는 물질이며, 뇌 허혈 손상 시 증가된matrix metalloproteinase에 의해 분해된다. 혈관내피세포에서 발현되는 eNOS와 이에 의해 생성된 NO는 혈관기능을 조절하는데 중요한 보호역할을 한다고 보고되었다. 또한ATF3는 전사조절 인자로서 뇌허혈과 같은 스트레스를 받았을 경우 혈관내피세포에서 발현이 증가되며 일부 유전자의 전사를 억제함으로써 보호효과를 보여주고 있다고 한다. 아그마틴은 아르기닌의 탈탄산효소에 의해 L-아르기닌의 탈탄산화에 의해 형성된 1차 아민으로 이전 연구에서 아그마틴의 신경보호 효과를 이미 보고한 바 있고, 또한NO 생성과도 연관되어 혈관 기능에 보호효과가 있다고 보고된바 있다. 본 연구에서는 이러한 아그마틴이 뇌허혈 손상 시 MMPs에 대한 조절작용을 관찰하였으며 그 기전에 대해 알아보았다. 연구 결과, 아그마틴이 MMP-2와 MMP-9의 발현은 감소시켰고, eNOS의 발현과 NO 생성은 증가시켰다. 아그마틴에 의한 MMP-2의 감소는 NOS 길항제인 L-NAME를 처리 시 아그마틴에 의해 여전히 감소하였으나, MMP-9의 발현은 감소되지 않았다. 따라서, 아그마틴 처리시 뇌혈관 내피세포에서 MMP-9의 감소는 eNOS와 이에 의해 생성된 NO의 증가와 어느 정도 연관성이 있음을 알 수 있었다. 또한 본 연구에서는 아그마틴을 생성하는 효소인 아르기닌의 탈탄산효소를 혈관내피세포에 infection시켜 내재적인 아그마틴을 생성하게 하였다. 내재적인 아그마틴 생성은 ATF3의 발현을 증가시키는 것을 관찰할 수 있었는데, L-NAME로 처리시 증가를 억제하였다. 또 ATF3의 siRNA를 이용하여 ATF3를 억제시켰을 경우 내재적 아그마틴에 의한 MMPs의 감소효과가 억제됨을 볼 수 있었다. 결론적으로, 아르기닌의 탈탄산효소를 혈관내피세포에 infection 시켜 내재적인 아그마틴을 생성하게 하였을 경우, eNOS의 발현과 NO 생성이 증가되며 이에 의한 ATF3발현양의 증가에 의해 MMP-2 와 MMP-9의 감소를 초래하게됨을 알 수 있다. 따라서, 결론적으로 아그마틴은 뇌허혈 손상 시 혈관내피세포에서 MMP-2 와 MMP-9의 발현을 억제함으로써 뇌혈관벽의 손상을 막는데 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있었다.

[영문]Agmatine is formed by the decarboxylation of L-arginine by the arginine decarboxylase (ADC). In this study, we found that agmatine decreased the MMPs expression in mouse cerebral endothelial cells. Matrix metalloproteinases (MMPs) are up-regulated by ischemia and degrade the basement membrane of brain vesssels to promote cell death and tissue injury. The eNOS expressed in the endothelial cells and nitric oxide generated by this enzyme play an important role in regulation of vascular reactivity. In this study we investigated the effect of agmatine administered exogenously and endogenously through overexpression of ADC. We performed RT-PCR and western blot analysis against MMP-2, MMP-9 and eNOS, and measured the production of NO using Griess reagent. While the expression of eNOS was increased after ischemic injury, the expression of MMPs was decreased by agmatine administered exogenously and endogenously. We also showed L-NAME (NOS inhibitor) altered the suppression of MMP-9 by exogenously administered agmatine, but not that of MMP-2. It seems that MMP-9 suppression by exogenously administrated agmatine is mediated, at least in part, via eNOS and the maintenance of functional NO release. Furthermore, we thought transcriptional regulation of MMP gene expression is influenced by some transcription factors. Activating transcription factor 3 (ATF3) is rapidly induced in response to a variety of stress such as ischemia reperfusion injury in endothelial cells. We found that ATF3 expression was increased significantly in ADC overexpression cells, but it was attenuated by NOS inhibitor. It seems that ATF3 expression is mediated eNOS in ADC overexpression cells. Furthermore, we found that the suppression of MMP-2 and MMP-9 by agmatine were attenuated in cells transfected with ATF3 siRNA. Our study indicated that the inhibition of MMPs expression by endogenously agmatine might be mediated via the regulation of ATF3. Taken together, these results suggest that endogenously administered agmatine suppress the MMP-2 and MMP-9 expression via eNOS-NO-ATF3-MMPs pathway.