Zinc finger protein을 이용한 VEGF-A promoter 활성화 조절 연구

Abstract

[한글]

신생 혈관 형성은 내재하는 혈관에서 새로운 모세 혈관이 자라나는 과정으로 vascular endothelial growth factor(VEGF)는 신생 혈관 형성의 가장 강력한 유도체이다. VEGF가 중재하는 신생 혈관 형성은 종양의 성장 및 침윤에 중요한 역할을 하기 때문에 항암 치료에 있어서 주된 표적이 되고 있다. 항암 치료를 위한 신생 혈관 억제와 반대로, 치료 목적의 신생 혈관 형성은 허혈 조직에 산소와 혈액을 공급하는 collateral vessel의 수를 증가시키는 혁신적인 방법이다. 따라서 VEGF의 발현을 조절할 수 있다면 신생 혈관 형성을 억제 혹은 촉진함으로써 항암 치료나 허혈성 질환 치료에 이용할 수 있다.진핵 전사 인자 중 가장 큰 그룹을 이루는 Cys2-His2 zinc finger protein을 이용하여 내재적인 표적 위치를 바로 인지하여 전사를 촉진하거나 억제하는 인공 전사 인자를 만들 수 있다. 이는 표적 DNA의 변형 없이 그 발현을 조절할 수 있다는 이점이 있다. 따라서 내재하는 VEGF-A 프로모터의 활성을 조절함으로써 모든 isoform의 발현을 조절할 수 있는 전사 억제 인자인 F435-kox와 활성화 인자인 F435-p65를 유전자 전달 효율이 높은 아데노바이러스에 삽입하였다.즉, 아데노바이러스의 E1 부위에 green fluorescent protein(GFP)을 표지 유전자로 도입하고 E3 부분에 F435-kox를 발현하는 복제 불능 아데노바이러스를 제작하여 VEGF 발현 억제 정도를 humanVEGF ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)를 수행하여 확인하였다. VEGF 발현 감소로 인한 혈관 내피 세포의 분화 능력 감소와 sprouting 감소를 tube formation assay와 aorta ring sprouting assay를 통하여 확인할 수 있었다. 이와 더불어 아데노바이러스의 E1B 유전자가 소실되고 E1A 부위 중 Rb와의 결합능이 소실된 종양 선택적 살상 아데노바이러스의 E3 부위에 F435-kox를 삽입하여 뛰어난 생체 내 항종양 효과를 확인하였다. 혈관 내피 세포 표지 인자인 CD31 발현 정도 확인을 통하여 종양 조직 내에서의 신생 혈관 억제 효과도 검증할 수 있었다. 또한, F435-p65를 GFP를 발현하는 복제 불능 아데노바이러스의 E3 부위에 삽입하여 VEGF 발현 촉진 정도를 hVEGF ELISA를 수행하여 확인하였고, 그 효과를 tube formation assay와 aorta ring sprouting assay를 통하여 다시 한 번 검증할 수 있었다.이와 같은 결과를 통하여 Ad-ΔE1GFP-kox와 Ad-ΔE1GFP-p65 모두 내재하는 VEGF-A 유전자의 발현을 효과적으로 조절할 수 있음을 확인할 수 있었다. 따라서 종양 선택적 살상 아데노바이러스 자체의 종양 선택적 살상능과 더불어 E1A 발현과 F435-kox 발현으로 유도된 VEGF-A 발현 억제로 인해 상승된 항종양 효과를 보이는 Ad-ΔB7-kox는 항암 치료에 유용하게 이용될 수 있을 것이라 생각된다. 모든 종류의 VEGF-A isoform을 발현시키는 Ad-ΔE1GFP-p65는 생체 내의 생리학적 신생 혈관 형성과 가장 유사한 효과를 유도하여 허혈성 질환이나 심혈관계 질환 치료에 효과가 있을 것으로 사료 된다.

[영문]Vascular endothelial growth factor (VEGF) is a most potent inducer of angiogenesis, the sprouting of new blood vessels from pre-existing vessels. VEGF is an attractive target for anti-cancer therapy because of its critical role of tumor growth and invasion. Unlike anti-cancer therapy, therapeutic angiogenesis is a progressive approach aimed at increasing the number of collateral vessels delivering oxygen and blood to ischemic tissue. Therefore, it can be used as anti-cancer therapy or ischemic disease treatment by inhibition or activation of angiogenesis, modulating VEGF expression.Artificial transcription factors based on Cys2-His2 zinc finger proteins (ZFPs) recognize an endogenous target site directly and could activate or inhibit transcription. For the aim to demonstrate the utility of ZFPs as therapeutic agents, in this study, we have generated adenoviruses expressing VEGF promoter-inhibiting ZFP (F435-kox) and VEGF promoter-activating ZFP (F435-p65). Replication-incompetent adenovirus expressing F435-kox, Ad-△E1GFP-kox, significantly down-regulated angiogenesis, showing reduced level of VEGF expression and inhibition of tube formation and vessel sprouting. In addition, oncolytic adenovirus expressing F435-kox, Ad-△B7-kox, elicited enhanced anti-tumor effect in comparison to its cognate control oncolytic adenovirus, Ad-△B7, in U87MG xenograft model. Furthermore, vessel density in tumor tissue treated with Ad-△B7-kox was greatly reduced compared to that in tumor treated with Ad-△B7. In the other hand, F435-p65 expressing adenovirus, Ad-△E1GFP-p65, induced therapeutic angiogenesis. The expression of VEGF-A in CASMC and AoSMC treated with Ad-△E1GFP-p65 increased two fold compared to that treated with Ad-△E1GFP. Additionally, the increased VEGF-A expression induced enhanced tube formation and vessel sprouting.In summary, these results demonstrated that artificial transcription factors based on zinc finger proteins could be potent regulators of gene expression with therapeutic promise in the treatment of disease.