Construction of artificial heart valves using decellularized allograft matrix

Abstract

[한글]

판막도관(valvular conduit)으로부터 분리된 세포외기질(extracellular matrix, ECM) Scaffold은 조직공학을 이용한 인공심장판막의 연구개발에 널리 사용되고 있다. 이러한 탈세포화 및 조직공학 기술을 이용한 세포외기질 scaffold은 심장판막 고유의 해부학적 형태, 구조 및 기계적 특성을 그대로 보유하고 있으며, 생체 내 판막 이식후의 석회화와 면역 반응을 최소화 시킬 수 있는 장점이 있다.본 연구에서는 protease inhibitor가 포함된 계면활성제인 sodium dodecyl sulfate (SDS)을 이용하여 돼지 대동맥 판막 탈세포 도관의 세포외 기질 scaffold를 제조한 후 동물모델에 이식하여 인공심장판막의 유용성을 평가하였다. 우선 돼지 대동맥 판막 도관을 채취하여 SDS로 탈세포화 시킨 다음 조직학적 검사와 전자현미경 검사를 시행하여 탈세포화를 확인하였다. 탈세포화 된 무세포 판막엽과 신선한 판막엽을 백서 피하이식 모델에 각각 이식하여 4주 동안 일주일 간격으로 판막엽 조직을 채취하여 조직학적 검사를 하고 원자흡광분광광도계를 이용한 칼슘함량을 측정하여 비교하였다. 또한 돼지 우심실 유출로에 탈세포화된 동종 판막도관을 이식하여 정기적으로 초음파 검사를 시행하여 판막기능을 평가하였으며, 1, 2, 3개월이 지난 후 각각 이식판막을 채취하여 조직학 및 면역조직화학염색 검사를 시행하였다.연구 결과, SDS로 탈세포화 시킨 심장판막에서 광학현미경을 이용한 조직학적 소견 및 전자현미경 소견으로 세포는 완전히 제거된 것을 확인할 수 있었으며, Masson''s trichrome 염색과 Miller''s elastin 염색을 시행하여 콜라겐, 엘라스틴과 같은 섬유조직은 잘 보존되어 있음을 확인하였다. 백서 피하에 이식한 경우 기간이 경과함에 따라 판막 내에 칼슘의 증가는 관찰되었으나 신선 판막엽을 이식한 경우에 비하여 4주째 칼슘의 함량은 통계적으로 유의하게 낮았다 (5.91±1.22 vs 10.78±3.03, p < 0.001). 돼지 모델 우심실유출로에 이식한 탈세포화된 인공판막은 3개월 동안 정상적인 기능을 보유하였으며, 역류나 협착은 발견되지 않았다. 1개월이 지난 후 이식 판막엽 표면에 자기세포가 점차적으로 부착되어 자라고 있는 소견이 조직학적 검사에서 관찰되었으며, 시간이 경과함에 따라 외연으로 확산되어 3개월 후 판막엽 표면의 약 80%를 덮고 있는 현상이 관찰되었다. α-actin 및 vWf 면역조직화학염색을 거쳐 상술한 세포가 내피세포와 myofibroblast임을 확인하였다.본 연구를 통하여 우리는 protease inhibitor가 포함된 SDS를 이용한 심장판막 탈세포화 방법은 매우 효과적이며, 이식 판막의 석회화를 감소시키는 것을 확인하였다. 아울러 탈세포화 된 동종 판막도관을 우심실 유출로에 이식했을 때 생체 내 기능과 내구성이 뛰어나며, 수여자 세포로 대치되고 있음을 관찰하였다.

[영문]Background: Extracellular matrix scaffolds isolated from valvular conduits can be useful for bioprostheses with tissue engineering technology provided that anatomical shape, architecture, and mechanical properties are preserved. Decellularization techniques and tissue engineering technologies applied to these tissues might improve in vivo function and durability. The aim of this study is to develop a technique for decellularization of the natural porcine heart valve matrix, and to evaluate calcification potential of decellularized valve leaflets and cell migration, durability as well as feasibility of allograft aortic valved conduit in the experimental model.Methods: Porcine aortic valves were decellularized using sodium dodecyl sulfate (SDS) treatment process. Fresh untreated valve leaflets and decellularized valve leaflets were evaluated in vitro using histology and transmission electron microscopy, and were subcutaneously implanted in juvenile male Sprague-Dawley rats. Leaflets were explanted at 1, 2, 3, and 4 weeks postimplantation and the calcium contents were determined in the explanted leaflets by atomic absorption spectroscopy. Decellularized porcine aortic valved conduits were implanted as a root replacement in the right ventricular outflow tract in pig models and were evaluated echocardiographically, histologically and immunohistochemically at 1, 2 and 3 months.Results: As evidenced by histological examinations, the SDS-treatment removed almost all the cellular components, and did not compromise the extracellular matrix of collagen and elastin fibers. Transmission electron microscopic evaluation revealed that leaflet extracellular matrix components retained native structural arrangements and morphologic interactions with collagen fibers, cell membranes and nuclei were almost completely removed. Calcium contents in fresh untreated valve leaflets appeared significantly higher than decellularized valve leaflets after 4 weeks implantation. (5.91±1.22 vs 10.78±3.03, p < 0.001, n=8). Echocardiographic examinations through 3 months revealed satisfactory function without regurgitation and stenosis in the right ventricular outflow tract. On gross examination, all leaflets were well preserved, and no calcification was observed. Microscopic analysis of the implanted valves became progressively recellularized with recipient cells. Immunohistological analysis revealed that these cellular components were endothelial cells (von Willebrand factor) and myofibroblasts (α-actin). However, endothelial cell regenerations were limited at the 80% of the leaflet's height after 3 months implantation.Conclusions: Decellularization protocol utilizing SDS with protease inhibitor was successful for valve decellularization which reduced calcium deposition in vivo. It may be said that the reduced calcification potential could result in improved long-term durability of decellularized heart valves as bioprostheses. These animal experiments of root replacement of right ventricular outflow demonstrate the practical feasibility of decellularized valve allografts for valve prostheses. These results indicate that the decellularized allogenic porcine valvular conduits hold promise for production of durable bioprosthetic valve that will be able to undergo probable turnover and/or remodeling by repopulating recipient cells.