Hypertonicity down-regulates 1α, 25-dihydroxyvitamin D3-induced osteoclastogenesis via Runx2 in co-culture system

Abstract

[한글]

뼈개조는 뼈를 형성하는 뼈모세포 (osteoblast)와 뼈흡수를 유발하는 뼈파괴세포 (osteoclast)에 의해 조절된다. 뼈파괴세포는 뼈파괴전구세포 (preosteoclast)로부터 분화되는데, 이 과정에 뼈모세포는 뼈파괴세포분화 촉진 인자인 RANKL와 M-CSF, 그리고 RANKL의 저해제인 OPG를 분비하여 뼈파괴세포 분화를 이끌어간다. 그러나 뼈파괴세포에 의해 뼈의 흡수가 일어나면, 뼈무기질의 분해산물로서 1) Ca2+이나 인산염, 2) 뼈유기질 성분인 아교질이나 osteonectin 등의 분해산물이 증가하게 되어 이차적인 뼈대사 조절이 유도된다. 특히 뼈흡수 과정에서 만들어진 여러 가지 분해산물에 의해 뼈모세포, 뼈파괴세포의 주위에 삼투압이 높은 이른바 hypertonic한 미세환경이 형성된다. 따라서 이 실험에서는 높은 삼투압이 뼈파괴세포 분화과정에 미치는 영향과 뼈대사에 미치는 영향을 분석하였다.1α, 25-dihydroxyvitamin D3 [1α, 25(OH)2D3] (10 nM)로 뼈모세포와 뼈파괴전구세포를 혼합배양하여 뼈파괴세포 분화를 유도한 후에 삼투압을 증가시키기 위하여 sucrose (25, 50, 100, 150, 200 mM)로 처리하였다. TRAP 염색법으로 핵이 3개 혹은 그 이상 존재하는 뼈파괴세포 수를 측정한 결과, sucrose의 농도가 증가함에 따라 그 수가 점차 감소하였으며, 뼈의 주요성분인 calcium phosphate nano crystal로 초박막 코팅된 OAAS 판을 이용하여 뼈흡수 능력을 비교한 결과에서도 뼈흡수 능력이 sucrose 농도 증가에 비례하여 점차 감소하는 것을 확인하였다. 한편 세포의 독성능 검사 결과 sucrose 50 mM까지 세포에 독성이 없었으며, 이는 sucrose 50 mM 이하의 농도에서는 1α, 25(OH)2D3에 의해 감소된 뼈파괴세포 형성이 삼투압 증가에 따른 결과라는 것을 의미한다. 높은 삼투압 환경이 뼈모세포의 특성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 역전사중합효소연쇄반응법 (RT-PCR)으로 뼈모세포의 분화에 관여하는 유전자 (osteocalcin, osteopontin, collagen 1)를 분석하였다. 높은 삼투압은 뼈모세포의 특성에는 영향을 미치지 않았다. 그러나 뼈모세포에서 만들어지면서 뼈파괴세포 형성에 결정적 인자인 RANKL과 M-CSF, OPG를 측정한 결과, sucrose의 농도가 증가함에 따라 RANKL mRNA가 점차적으로 감소하였고 M-CSF, OPG의 발현에는 변화가 없었다. 이를 효소면역측정법 (ELISA assay)과 면역검색법 (western blot)으로 RANKL의 변화를 정량적으로 검색한 결과 RT-PCR 결과와 마찬가지로 RANKL이 sucrose 농도가 증가함에 따라 감소하였다. 이는 뼈모세포에서 높은 삼투압이 RANKL 발현을 억제하여 뼈파괴세포 분화를 억제한다는 것을 의미한다.이와 같이 높은 삼투압이 RANKL 발현을 억제하여 뼈파괴세포 분화를 억제하였지만, RANKL 유전자의 촉진염기서열 (promoter)에는 Runx2 결합위치가 있고 이 결합부위를 돌연변이 (mutation)시키면 RANKL의 전사가 이루어지지 않는다. 이는 RANKL 발현에 Runx2가 밀접하게 관련되어 있음을 나타내는 결과로 받아들이고, 면역검색법을 통하여 뼈모세포의 1α, 25(OH)2D3에 의해 증가되었던 Runx2 발현이 높은 삼투압에 의해 감소되는 것을 확인하였다. 또한 Runx2 간섭유전자 (RNA interference)를 뼈모세포에 이입 (transfection) 시켰을 때 1α, 25(OH)2D3에 의해 발현되는 RANKL mRNA나 단백질의 양이 현저히 감소되었으며, 간섭유전자처리를 거친 뼈모세포를 뼈파괴전구세포와 혼합배양 시, 뼈파괴세포 형성이 현저히 억제되었다.이상의 사실로 미루어 보아 뼈흡수가 활발히 일어나 형성된 세포주위의 삼투압 증가는 뼈파괴세포 형성을 억제하는데, 이는 뼈모세포의 Runx2 발현을 억제하여 이차적으로 RANKL 발현을 떨어뜨리기 때문에 발생되는 결과로 해석된다. 따라서 hypertonicity는 뼈파괴를 조절할 수 있는 새로운 뼈대사 조절인자로 생각된다.

[영문]Bone integrity is maintained through bone remodeling which is consisted of bone formation and resorption. Osteoblast/stromal cells can express RANKL (receptor activator of NF-κB ligand), M-CSF (macrophage colony-stimulating factor), and OPG (osteoprotegerin). RANKL and M-CSF are essential and sufficient to promote osteoclastogenesis. By contrast, OPG is a secretory protein which binds to RANKL, resulting in blockade of RANKL/RANK axis. When bone is actively resorbed, it might be possible that high osmolality is provided due to the high concentration of Ca2+, PO42-, and the degraded organic materials in the extracellular fluid around bone cells. Therefore, we demonstrated the effects of hypertonicity on osteoclastogenesis in osteoblast (from calvariae)-preosteoclast (bone marrow) co-culture system for the purpose of understanding the hypertonicity on bone metabolism at the molecular level.Hypertonicity (high osmolar sucrose) down-regulates 1α, 25-dihydroxy-vitamin D3 (1α, 25(OH)2D3)-induced osteoclastogenesis in co-culture system. Namely, hypertonicity (sucrose 25, 50 mM) inhibits number of tartrate-resistant acid phoshoatase (TRAP) positive multinucleated cells and pit formation induced by 10 nM 1α, 25(OH)2D3. In a viability test, sucrose did not show any toxic effect in these concentrations. The mRNA expressions of RANKL, OPG and M-CSF were analyzed by RT-PCR, and RANKL was detected with Western blot and ELISA assay, in order to investigate the mechanism by which hypertonicity inhibits osteoclastogenesis. In hypertonic conditions, expression of RANKL and its mRNA were decreased in dose-dependent manner, while the changes in OPG and M-CSF were not detected significantly. Namely, hypertonicity inhibits osteoclast differentiation by reducing the expression ratio of RANKL/OPG in differentiated osteoblastic cells. However, osteoblast marker genes as well as osteopontin, collagen 1 and osteocalcin expressions were not changed in hypertonic conditions, which indicate calvarial osteoblastic cell specific character was not affected with hypertonicity. Runx2 (Runt-related transcription factor 2)/Cbfa1 (Core-binding factor alpha 1 subunit)/Pebp2αA (Polyomavirus enhancer binding protein 2 alpha A subunit)/AML3 (acute myeloid leukemia 3 protein), which is an essential transcriptional factor that regulates osteoblast differentiation. In this study we clarify whether the Runx2 is linked to 1α, 25(OH)2D3-induced osteoclastogenesis in hypertonic condition. Because RANKL gene basic promoter sequence has several binding sites for Runx2 and mutation of these sites abrogates the transcriptional activity of the RANKL promoter. We measured the Runx2 expression by Western blot in the presence or absence of hypertonicity. 1α, 25(OH)2D3 caused the increase of Runx2 expression in osteoblastic cells. Such increase in 1α, 25(OH)2D3-induced Runx2 expression was blunted by hypertonicity, suggesting that hypertonicity could elicit the partial inhibition of osteoclastogenesis due to the supression of Runx2 expression. To confirm this possibility, RNA interference of Runx2 was transfected into the osteoblastic cells. In these transfected cells, 1α, 25(OH)2D3-induced RANKL expression and TRAP-positive cells formation were remarkably decreased.Taken all together, these findings reveal that hypertonicity around bone cells was supported by active osteoclasts down-regulates 1α, 25(OH)2D3-induced osteoclastogenesis, is via Runx2. Because under the hypertonic condition, 1α, 25(OH)2D3-induced Runx2 expression was suppressed and then inhibited of RANKL synthesis. Therefore, hypertonicity may be a novel candidate for the regulation of bone metabolism through affect bone resorption.