DHPLC를 이용한 염색체의 duplication/deletion 분석

Abstract

[한글]

염색체의 duplication과 deletion은 염색체의 구조에 큰 영향을 미친다. Duplication과 deletion은 일어난 곳에 부분적인 3염색체성과 1염색체성을 유발하여 해당 gene의 기능적 이상을 나타내게 되며 이로 인하여 CMT1A, HNPP, Williams-Beuren 증후군, DiGeorge 증후군 그리고 Rubinstein-Taybi 증후군 등의 유전 질환이 발생한다. 이들 질환의 Duplication/Deletion을 진단하기 위한 기존의 방법들은 southern blot analysis, fluorescence in situ hybridization (FISH), pulsed field gel electrophoresis (PFGE), polymorphic short tandem repeats (STR) analysis, endpoint quantitative PCR and real-time quantitative PCR 분석법 등이 있었다. 그러나 기존의 진단 방법들은 각기 장점과 단점이 존재했다. 새로운 방법으로 CMT1A와 HNPP 진단을 하는 경우 PCR을 통해 PMP22 gene의 duplication과 deletion 지역을 증폭하여 이를 DHPLC와 연계하여 진단하여 DHPLC의 정량분석기능에 의해 고가의 Realtime-PCR 장비 없이도 쉽고 빠르게 결과를 낼 수 있었으며 가족의 검체 없이도 internal-control과의 비교를 통해서 환자의 이상 유무를 진단해 낼 수 있었다.본 연구에서는 염색체의 dupilcation과 deletion으로 발생하는 여러 유전 질환들 중 CMT1A와 HNPP에 해당하는 환자들로 연구를 진행하였다. 우성으로 유전되는 Charcot-Marie-Tooth type 1A Disease (CMT1A) 와 Hereditary neuropathy with liability to pressure palsies (HNPP)는 선천성 말초신경병증으로 CMT1A와 HNPP의 주요 원인으로는 Peripheral Myelin Protein 22 (PMP22) Gene을 포함하는 염색체 17p11.2 부위에 1.5-Mb 지역의 Duplication 과 Deletion이 대부분을 차지한다.DNA는 CMT1A와 HNPP 환자들 그리고 정상대조군에서 각 각 10개씩 선택하였으며 실험자의 편견이 결과에 작용하지 않도록 30개의 DNA를 무작위로 섞은 후 진행하였다.PMP22 gene 내에 위치한 STR marker인 D17S122와 D17S261을 사용하여 PCR 하였으며 정확한 PCR의 여부와 비율 측정을 위하여 Albumin gene 내에 위치한 internal-control primer를 이용, STR marker와 함께 multiplex-PCR 후 DHPLC의 분석을 통해 결과를 알아보았다.DHPLC 분석 결과 전체에서 여섯 종류의 결과를 관찰할 수 있었으며 이 결과를 종류별로 분류하였으며 다음과정으로 real-time PCR 결과와 비교, 확인 하였다. 비교 결과 DHPLC를 이용한 분석법은 PMP22 gene의 변이 여부를 정확히 분석해냈다. DHPLC를 이용한 PMP22의 duplication, deletion 분석 방법은 간단하고 빠르며 또한 재연성 있는 결과를 이끌어낼 수 있다. 이러한 결과는 염색체의 duplication과 deletion으로 발생하는 여러 가지 유전 질환들의 진단에 도움을 줄 수 있을 것이다.

[영문]Duplications and Deletions are important structural aberrations of chromosome. Duplication of a chromosomal segment lead to partial trisomy, resulting in functional imbalance of the genes contained in the involved region. Deletion, which causes hemizygosity and functional haploinsufficiency for the loci involved, may occur de novo or be the result of the meiotic segregation of a parental balanced reciprocal translocation. By Chromosomal duplication/ deletion some genetic disease were generated like CMT1A, HNPP, Williams-Beuren syndrome, Wolf-Hirschhorn syndrome, Rubinstein-Taybi syndrome and etc.For molecular diagnosis of duplication or deletion of the gene, several approaches are available ; Southern blot analysis, fluorescence in situ hybridization (FISH), real-time quantitative PCR analysis. However, there are several limitations in each method.In this study we proceed with the CMT1A and HNPP patients.Charcot-Marie-Tooth disease (CMT) and hereditary neuropathy with liability to pressure palsies (HNPP) are the most frequent inherited disorders of the peripheral nervous system.To develop method for detection of 1.5 Mb duplication & deletion in CMT1A & HNPP patient we analyzed 10 patients clinically diagnosed with CMT1A, 10 patients HNPP and 10 normal controls.To avid a bias we mixed randomly 30 whole samples and proceed with the program as arranged.Gene dosage of the region was determined by PCR with D17S122, D17S261 and internal-control primer follow by DHPLC analysis.Quantitative DHPLC analysis result classified with six types. DHPLC results showed that samples with duplication/deletion of PMP22 gene have different patterns.DHPLC analysis results consisted with Real-time quantitative PCR analysis and it showed correct determination of the PMP22 gene copy number. This method is fast, easy and reproducible in detecting gene duplication and deletion in CMT1A and HNPP patients, respectively. This method might be very helpful for the diagnosis of patients with caused by gene duplication/deletion.