재조합 인체 디스인테그린의 혈소판응집 억제 효과

Abstract

[한글]

급성 관동맥 증후군 등 혈전 관련 질환에서 혈소판의 glycoprotein (GP) IIb/IIIa 수용체 억제를 통한 혈소판응집 억제가 중요한 치료법으로 사용되고 있으나, 더 이상적인 항혈소판 약물에 대한 연구가 지속적으로 이루어지고 있다. GP IIb/IIIa 수용체에 대한 억제 효과가 있는 뱀독 디스인테그린과 구조가 유사한 A Disintegrin And Metalloproteinase (ADAM)이 최근 인체에서 발견되었으나, 혈소판응집 억제에 대한 이 물질의 효과는 불확실하다. 이에 본 연구에서는 재조합 인체 디스인테그린과 이 중 Arg-Gly-Asp (RGD) 부근 서열을 포함하는 펩타이드의 혈소판응집 억제 효과를 평가하고자 이 연구를 시행하였다.인간 제대정맥 내피세포에서 ADAM 15 유전자 cDNA를 클로닝하고, 효모 균주에서 대량발현하여 인체 유래 디스인테그린을 생산하였으며, ADAM 15의 RGD주변 서열을 변형한 cyclic 펩타이드 (A1)를 합성하였다. 혈소판응집 측정기에서 대조 약물인 뱀독 유래 디스인테그린 saxatilin, ADAM 15 유래 디스인테그린, cyclic 펩타이드 A1을 이용하여 혈소판응집 억제 효과를 측정하였으며, mouse 경동맥 혈전 모델에서 각 물질에 의해 혈전에 의한 혈관폐쇄 시간이 얼마나 지연되는 지 측정하였다. 또한 다른 인테그린에 대한 ADAM 15 유래 디스인테그린의 영향을 확인하기 위해 avb3에 대한 결합을 통한 세포부착 억제를 조사하였다.혈소판응집 억제 실험에서 대조군으로 이용한 뱀독 유래 디스인테그린인 saxatilin은 인간 혈소판에서 IC50가 약 137 nM였으며, 재조합 ADAM 15 단백질은 약 50 mM, cyclic 펩타이드 A1은 약 100 mM, linear 펩타이드 GRGDSP가 약 270 mM이었다. Mouse 경동맥 혈전 모델을 통한 실험 결과, ADAM 15 유래 디스인테그린은 혈전에 의한 동맥폐쇄 지연 효과가 낮았으나, cyclic 펩타이드 A1은 80mg/kg 용량에서 대조 약물인 saxatilin과 동맥폐쇄 지연 효과가 비슷하였다. 인간 제대정맥 내피세포와 vitronectin과의 부착 실험에서 ADAM 15 유래 디스인테그린의 IC50는 약 21uM로써, 이 단백질이 GP IIb/IIIa보다 avb3에 특이성이 높음을 알 수 있었다.위의 결과로 보아 인체 ADAM 15 유래 디스인테그린은 뱀독 유래 디스인테그린 보다 혈소판응집 억제 효율이 낮았는데 이는 RGD loop 구조의 차이에 기인한다고 생각된다. 따라서 뱀 독 디스인테그린의 RGD loop와 유사한 구조로 변형된 디스인테그린 변이체를 추가로 개발한다면 면역 반응은 최소화하면서도 혈소판응집 억제 활성이 높은 새로운 항혈소판제로 활용이 가능할 것으로 기대된다.

[영문]Snake venom-derived disintegrin is a family of low molecular weight, cysteine-rich, RGD-containing peptides that inhibit the binding of ligands to the glycoprotein IIb/IIIa receptor on the platelets, and this is known to mediate the final common pathway in platelet aggregation. A Disintegrin And Metalloproteinase (ADAM) was recently discovered in humans, and it contains a disintegrin domain that shows high homology with the snake venom disintegrin. However, the effect of ADAM on platelet aggregatioin is not yet clear. The aim of this study was to evaluate the antiplatelet effect of ADAM-derived recombinant human disintegrin and the synthetic peptides that were produced on the basis of the RGD sequence of this disintegrin.A cDNA encoding the disintegrin domain of ADAM 15 was cloned, expressed and then highly purified in Pichia pastoris. The cyclic peptides were synthesized on the basis of the sequence including the RGD pepetides on ADAM 15. The antiplatelet effects of saxatilin, snake venom disintegrin, ADAM 15-derived human disintegrin, and the ADAM 15-derived cyclic peptides was analyzed using a platelet aggregometer. The antithromotic effect of these peptides was evaluated by measuring the occlusion time after the induction of thrombosis in a mouse carotid artery occlusion model.The IC50 for the human platelets was 137 nM, 50 uM, 100 uM, and 270 uM for saxatilin, ADAM 15-derived disintegrin, cyclic peptide A1, and the peptide GRGDSP, respectively. Although ADAM 15-derived disintegrin showed no detectable effect to prolong the time to occlusion, cyclic peptide A1 (80 mg/kg) exhibited a significant prolongation time similar to saxatilin (2.1 mg/kg). In contrast, ADAM 15-derived disintegrin exhibited stronger inhibitory effect on adhesion of HUVEC to vitronectin, with an IC50 of 21 uM.In conclusion, ADAM 15-derived human disintegrin exhibited a much weaker antiplatelet effect than did the snake venom-derived disintegrin, suggesting that the 3-dimensional structure may be crucial for their biological activiey. This work is the first report on the mass production of human disintegrins in recombinant Yeast P. pastoris as well as on the in vivo antithrombotic effects of human disintegrins.