고포도당이 족세포내 국소 레닌-안지오텐신계에 미치는 영향

Abstract

[한글]

안지오텐신 II (angiotensin II, ANG II)는 강력한 혈관 수축제로서 당뇨병성 신병증의 발생 및 진행에 중요한 역할을 담당하고 있으며, 최근에는 전신적인 역할보다도 신장내의 국소적인 안지오텐신 II의 증가가 더욱 중요한 것으로 밝혀지고 있다. 그러나, 고포도당에 의하여 안지오텐신 II가 증가하는 기전은 실험 세포에 따라 차이가 있으며, 특히, 족세포에서는 고포도당에 의한 국소 renin-angiotensin system (RAS)의 활성화 기전이 아직까지 명확하게 규명되어 있지 않다. 이에 연구자는 고포도당 조건 하에서 배양한 족세포에서 국소 RAS의 변화를 구성 성분별로 분석하여 고포도당 자극에 의한 안지오텐신 II의 생성 증가 기전을 알아보기 위하여 정상 포도당, 정상 포도당+만니톨, 그리고 고포도당 조건 하에서 24시간 동안 배양한 족세포에서 국소 RAS의 구성 성분인 안지오텐시노겐 (angiotensinogen, AGT), 레닌 (renin), 안지오텐신 전환 효소 (angiotensin-converting enzyme, ACE), 안지오텐신 I (angiotensin I, ANG I), ANG II, 그리고 ANG II 제 1형 수용체 (ANG II type I receptor, AT1R)의 발현 및 농도의 변화를 각각 조사하여 다음과 같은 결과를 얻었다.족세포내 AGT mRNA 발현은 고포도당군에서 정상 포도당군에 비하여 의미있게 증가되었으나 (p<0.01), renin mRNA 및 활성도는 양군 간에 유의한 차이가 없었다. 족세포 용해액과 배양액에서 측정한 ANG I과 ANG II의 농도는 고포도당군 (ANG I; 세포 용해액 36.7±10.9 pg/μg protein, 배양액 362.5±35.7 pg/μg protein, ANG II; 세포 용해액 20.6±2.3 pg/μg protein, 배양액 118.7±15.7 pg/μg protein)에서 정상 포도당군 (ANG I; 세포 용해액 16.9±5.2 pg/&#61549;g protein, 배양액 110.3±14.6 pg/μg protein, ANG II; 세포 용해액 7.1±0.3 pg/μg protein, 배양액 70.8±10.7 pg/μg protein)에 비하여 의미있게 높았다 (p<0.05). ACE mRNA 발현은 고포도당 조건 하에서 배양한 족세포군과 정상 포도당군 사이에 차이가 없었으며, ELISA와 Western blot을 이용하여 측정한 ACE 농도와 단백 발현도 양군 간에 의미있는 차이가 없었다. AT1R mRNA와 단백 발현은 고포도당군에서 정상 포도당군에 비하여 각각 186%, 75% 증가되었다 (p<0.05). 만니톨군과 정상 포도당군 사이에 각 구성 성분의 농도 또는 발현에는 유의한 차이가 없었다.이상의 실험 결과로 미루어, 족세포에서 고포도당에 의한 ANG II의 생성 증가를 확인할 수 있었으며, 이러한 증가는 기질인 AGT의 증가에 기인하였을 것으로 생각된다. 이러한 ANG II의 생성 증가와 더불어 고포도당에 의한 AT1R의 발현 증가가 당뇨병에 의한 족세포 손상에 관여할 것으로 사료된다.

[영문]Introduction: Renin-angiotensin system (RAS) plays an important role in the pathogenesis of various renal diseases, including diabetic nephropathy (DN). Recently, the activation of local RAS in mesangial cells by high glucose (HG) has been reported. However, little is known about the changes of RAS in podocytes under HG conditions and the mechanisms of RAS activation in podocytes. In this study, we elucidated whether RAS was activated in HG-stimulated podocytes and which component of RAS mediated this process. Methods: Immortalized mouse podocytes were cultured in RPMI medium containing NG (5.6mM glucose), NG+M (24.4mM mannitol), or HG (30mM glucose) for 24 hours after differentiation at 37°C (non-permissive condition). Cells were harvested for either RNA or protein, and media were collected. Real time-PCR was performed for angiotensinogen (AGT), renin, angiotensin-converting enzyme (ACE), and angiotensin II type I receptor (AT1R) mRNA expression. ACE levels in cell lysates, and angiotensin (ANG) I and ANG II concentrations in cell lysates and in media were measured by ELISA. Renin activity was determined by measuring ANG I levels after incubation with excess of porcine AGT (1μM) for 1 hour at 37°C. Western blot analysis for ACE and AT1R protein expression was also performed.Results: AGT mRNA expression was significantly increased in HG podocytes (1.9-fold compared with NG cells, p<0.01), but renin and ACE mRNA expression were not different between the two groups. ANG I concentrations were significantly higher in HG cells lysates (HG; 36.7±10.9, NG; 16.9±5.2 pg/μg protein, p<0.05) and in HG media (HG; 362.5±35.7, NG; 110.3±14.6 pg/μg protein, p<0.05). In addition, ANG II concentrations were also significantly higher in HG cells lysates (HG; 20.6±2.3, NG; 7.1±0.3 pg/μg protein, p<0.05) and in HG media (HG; 118.7±15.7, NG; 70.8±10.7 pg/μg protein, p<0.05). In contrast, there were no differences in renin activity and ACE levels between the two groups. Mannitol had no effect on these changes of RAS components in podocytes. AT1R mRNA and protein expression were increased by 186% and 75% in HG-stimulated podocytes compared with NG cells (p<0.05).In conclusion, HG induced AGT mRNA expression in cultured podocytes, resulting in increased ANG I and ANG II production. In addition, despite of higher ANG II concentrations, AT1R mRNA and protein expression were also increased in HG-stimulated cells. These findings suggest that increased both ANG II production and AT1R expression in podocytes under HG conditions may play an important role in the pathogenesis of DN.