당뇨병성 신증의 발생과 진행에 있어서 plasminogen activator inhibitor-1의 역할

Abstract

[한글]

당뇨병성 신증은 말기 신부전증을 유발하는 가장 흔한 원인질환이며 신장내 세포외 기질(extracelluar matrix: ECM)의 과다한 축적을 특징으로 한다. ECM의 축적은 ECM의 생산과 분해의 균형에 의하여 조절되고 사구체 혈관간의 확장과 세뇨관 간질의 섬유화를 유발한다. Plasminogen activator (PA)/plasmin/PA inhibitor-1 (PAI-1)계와 matrix metalloproteinase (MMP)/tissue inhibitor of metalloproteinase (TIMP)계는 ECM 분해에 중요한 역할을 하는 효소계이다. PAI-1은 PA와 1:1 결합하여 PA에 의한 plasmin 생산을 억제하고 MMP의 활성화도 억제함으로써 신장내 ECM 재구성에 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다. PAI-1은 당뇨병 신장에 과표현 되고 포도당과 transforming growth factor (TGF)-β1에 의하여 신장내 표현이 상향 조절된다. 그러나 PAI-1의 당뇨병성 신장내 ECM 축적에 있어서의 역할과 기전에 대한 보고는 한정되어 있다. 본 연구는 PAI-1 유전자 결핍 생쥐와 PAI-1 유전자 결핍 생쥐에서 분리한 사구체 혈관간 세포, PAI-1 siRNA를 일시적으로 세포내 전이하여 PAI-1 유전자를 억제한 세뇨관 상피 세포 NRK-52E 세포를 이용하여 당뇨병성 신증의 발생과 진행에 있어서 PAI-1의 역할을 규명하고자 하였다. Jackson Lab에서 구입한 생후 8 주 된 C57BL/6J 계의 PAI-1+/+와 PAI-1-/- 생쥐에 5일간 streptozotocin (STZ) 50 mg/kg을 복강내로 투여하여 당뇨를 유발하였다. PAI-1+/+와 PAI-1-/-에서 분리한 사구체 혈관간 세포는 고농도의 포도당(30 mM)과 TGF-β1 (2 ng/ml)으로, PAI-1 siRNA를 세포내 전이시킨 세뇨관 상피 세포는 TGF-β1 (2 ng/ml)으로 자극하였다. 각 동물에서 STZ 주사 전과 20 주 후에 몸무게, 혈당, 요와 혈장 크리아티닌, 요배설양, 알부민 배설율을 측정하였고 당뇨 유발 후 20주에 희생시켜 신장을 적출하였다. 적출한 신장 조직을 periodic acid-schiff (PAS) 염색하여 사구체 용적(glomerular volume: VG)과 혈관간질 분획(fractional mesangial area: FMA)을 Image-Pro program으로 측정하였고 mRNA는 real time RT-PCR로 단백은 Western blot과 면역조직 화학 염색 그리고 ELISA로 분석하였다. Plasmin 활성은 spectrofluorometer로 측정하였으며 MMP 활성은 zymography로 분석하였다. 통계 처리는 ANOVA와 Fisher의 최소 유의차 검정법으로 시행하였다. PAI-1+/+ 당뇨 생쥐에서는 비당뇨 대조군에 비하여 신장무게, 신장/체중비, 요배설양, 혈당, 요와 혈장 크리아티닌, 알부민 배설율, VG, FMA 그리고 피질부 fibronectin (FN), collagen I (Col I), collagen IV (Col IV), TGF-β1 그리고 monocyte chemoattractant protein (MCP)-1의 mRNA와 단백 표현이 유의하게 증가하였다. PAI-1-/- 당뇨군에서는 PAI-1+/+ 당뇨군에 비하여 혈당은 차이가 없었으나 FMA, FN과 Col I mRNA 및 FN, Col I 그리고 IV 단백이 유의하게 감소하였다. 비당뇨 대조 PAI-1-/-군에서는 비당뇨 PAI-1+/+ 대조군에 비하여 basal plasmin과 MMP 활성이 증가되어 있었으나 당뇨군에서는 PAI-1+/+와 PAI-1-/-간에는 차이가 없었다. PAI-1+/+ 생쥐에서 분리한 사구체 혈관간 세포에서 고포도당과 TGF-β1 자극에 의하여 PAI-1은 유의하게 증가하였으며 plasmin 활성은 억제되었다. PAI+/+ 생쥐의 혈관간 세포의 FN, Col I, TGF-β1과 MCP-1 mRNA는 고포도당과 TGF-β1에 의하여 증가하였다. PAI-1-/- 혈관간 세포에서 고포도당과 TGF-β1에 의한 Col I mRNA와 단백 그리고 TGF-β1에 의한 TGF-β1 mRNA 표현은 PAI-1+/+ 혈관간 세포에 비하여 유의하게 감소하였다. 고포도당과 TGF-β1에 의하여 plasmin의 활성은 PAI-1-/-에서도 감소하였으나 PAI-1+/+ 혈관간 세포에 비하여 유의하게 증가하였다. PAI-1-/- 혈관간 세포의 MMP 활성 또한 PAI-1+/+ 혈관간 세포에 비하여 증가되었다. 세뇨관 상피 세포에 PAI-1 siRNA를 전이시킨 경우 scramble sequence 전이군에 비하여 PAI-1의 mRNA와 단백이 유의하게 감소되는것을 확인하였다. Scramble sequence 전이군에서는 TGF-β1 자극에 의하여 FN과 Col I의 mRNA와 단백 표현이 현저히 증가하였으나 PAI-1 siRNA 전이군에서는 현저히 감소되었다. PAI-1 siRNA는 대조군과 TGF-β1 자극군에서 다같이 plasmin의 활성을 증가시켰다. 본 연구의 결과는 PAI-1 유전자 결핍이 plasmin과 MMP 활성 증가를 통하여 ECM 분해를 증가시킬 뿐 아니라 TGF-β1, FN, Col I mRNA의 하향조절을 통하여 ECM 생산을 감소시킴을 시사한다. 따라서 PAI-1은 ECM 분해 감소 뿐 아니라 생산의 증가를 통하여 당뇨병성 신장내 ECM 축적을 촉진함으로써 당뇨병성 신증의 발생과 진행에 있어서 중요한 역할을 함을 시사하였다.

[영문]Excessive accumulation of extracellular matrix (ECM) in the kidney is the major pathologic feature of diabetic nephropathy. The amount of ECM deposited in the kidney depends on the balance between synthesis and degradation. Plasminogen activator (PA)/plasmin/PA inhibitor-1 (PAI-1) system and matrix metalloproteinase (MMP)/tissue inhibitor of metalloproteinase (TIMP) system are major protease systems involved in ECM degradation. PAI-1 is known to play a critical role in ECM remodeling in the kidney through inhibition of the generation of plasmin and activation of MMP. PAI-1 is up-regulated by high glucose and TGF-β1 and is overexpressed in pathologic conditions associated with renal fibrosis including diabetic nephropathy. The present study examined the contribution of PAI-1 and the mechanisms involved in the development and progression of diabetic renal injury using PAI-1 knock-out (KO) (PAI-1-/-) mice, mesangial cells isolated from PAI-1-/- mice, and renal tubular epithelial cells transiently transfected with PAI-1 siRNA. STZ 50 mg/kg was administered intraperitoneally for 5 days to C57BL/6J wild (PAI-1+/+) or KO mice. Body weight, kidney weight, plasma glucose, urine and plasma creatinine, urine volume, and protein excretion rate were measured before and 20 weeks after STZ. Glomerular volume (VG) and fractional mesangial area (FMA) were assayed by Image-pro. Growth arrested and synchronized primary mesangial cells isolated from PAI-1+/+ and PAI-1-/-mice were treated with high glucose (30 mM) and TGF-β1 (2 ng/ml). Normal rat tubular epithelial (NRK-52E) cells transiently transfected with siRNA for PAI-1 was treated with TGF-β1 (2 ng/ml). Fibronectin (FN) and collagen I (Col I) and IV (Col IV) proteins were analyzed by Western blot analysis and immunohistochemistry, mRNA expression by real-time RT-PCR, plasmin activity by spectrofluorometer, and matrix metalloproteinase (MMP) activity by zymography. Diabetic PAI-I+/+ mice showed increased kidney weight, kidney/body weight ratio, urine and plasma creatinine, urine volume, proteinuria, VG, FMA, mRNA expression of FN, Col I, TGF-β1 and MCP-1, and protein expression of FN, Col I, and Col IV compared to control PAI-1+/+ mice. Diabetic PAI-1-/- mice had similar hyperglycemia as diabetic PAI-1+/+ but had decrease in FMA, FN and Col I mRNA and protein expression and Col IV protein expression compared to diabetic PAI-1+/+ mice. Plasmin and MMP activity was significantly increased in non-diabetic control PAI-1-/- mice compared to non-diabetic control PAI-1+/+ mice but was not different between the two diabetic groups. High glucose and TGF-β1 significantly increased PAI-1 and Col I mRNA and protein expression in PAI-1+/+ mesangial cells and decreased plasmin activity in both PAI-1+/+ and PAI-1-/- mesangial cells as compared to control. Control as well as high glucose- and TGF-β1-stimulated plasmin and MMP-2 activity was, however, significantly higher in PAI-1-/- than in PAI-1+/+ cells. High glucose- and TGF-β1- induced Col I mRNA and protein and TGF-β1 mRNA expression was significantly lower in PAI-1-/- than in PAI-1+/+ mesangial cells. PAI-1 siRNA significantly decreased PAI-1 expression and increased plasmin activity in both control and TGF-β1-treated tubular epithelial cells and significantly decreased TGF-β1-induced FN and Col I mRNA and protein expression when compared to scramble RNA transfected cells. These data suggest that PAI-1 deficiency attenuates glomerular mesangial expansion and ECM accumulation in diabetic kidney not only through increased ECM degradation but also through decreased synthesis. Therefore, PAI-1 may play an important role in the development and progression of diabetic nephropathy by facilitating ECM accumulation in the kidney.