The effect of cyclosporine on P-cadherin expression in experimental diabetic nephropathy and glucose-stimulated podocytes

Abstract

[한글]

배 경: 당뇨병성 신병증은 말기 신부전증의 원인 질환 중 가장 많은 빈도를 차지하는 질환으로, 특징적인 임상 소견인 단백뇨는 사구체 여과 장벽 (glomerular filtration barrier)의 크기 선택성 (size selectivity) 또는 전하 선택성 (charge selectivity)의 소실로 인해 발생되는 것으로 알려져 있다. 세극막은 사구체 여과 장벽의 구성 성분인 족세포에서 기원한 족돌기들을 연결하는 구조로, 여기에는 P-cadherin 등의 단백이 존재하는 것으로 보고되어 있다. 싸이클로스포린은 장기 이식 후 흔히 사용하는 면역억제제일 뿐만 아니라, 여러 사구체 질환에서 단백뇨 감소 효과가 있는 것으로 알려져 있으나, 당뇨병성 신병증에서의 효과에 대한 연구는 미미한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 여러 사구체 질환에서 관찰되는 싸이클로스포린의 단백뇨 감소 효과가 당뇨병성 신병증에서도 관찰되는지를 알아봄과 동시에, 세극막 관련 단백의 하나인 P-cadherin의 발현 변화와의 연관성에 대해 연구하고자 하였다.방 법: 24마리의 Sprague-Dawley 백서를 대조군 (8마리), 당뇨군 (8마리), 그리고 싸이클로스포린 (1.5 mg/kg/day, 피하투여) 처치 당뇨군 (8마리)으로 나누어 사육한 뒤, 당뇨 유발 6주 후에 분리한 사구체를 이용하여 calcineurin A-α, calcineurin A-β, P-cadherin, TGF-β1 mRNA와 단백 발현의 변화를 각각 RT-PCR과 Western blot을 이용하여 관찰하였으며, 조직내 P-cadherin의 발현 변화는 면역형광 염색법을 이용하여 관찰하였다. 또한, 불멸 생쥐 족세포 (immortalized mouse podocytes)를 정상 포도당군 (5.6 mM), 정상 포도당+만니톨군 (24.4 mM), 정상 포도당+싸이클로스포린(10-8 M) 처치군, 정상 포도당+ TGF-β1 (10 ng/ml) 처치군, 고포도당군 (30 mM), 또는 고포도당+싸이클로스포린 (10-8 M) 처치군으로 나누어 24시간 배양한 후 RT-PCR과 Western blot을 시행하였다.결 과:1. 24시간 뇨알부민 배설은 대조군 (0.32±0.02 mg)에 비해 당뇨군 (1.28±0.11 mg)에서 의의있게 높았으며, 싸이클로스포린 처치 당뇨군 (0.62±0.18 mg)에서는 당뇨군에 비해 뇨알부민 배설 증가가 유의하게 억제되었다 (p<0.05).2. 사구체내 calcineurin A-α mRNA와 단백의 발현은 당뇨군에서 대조군에 비해 각각 2.1배, 2.2배 증가되었으나 (p<0.05), calcineurin A-β mRNA와 단백의 발현은 두 군 사이에 유의한 차이가 없었다.3. 사구체내 P-cadherin mRNA와 단백의 발현은 당뇨군에서 대조군에 비해 각각 40.2%, 56.1% 감소되었으며 (p<0.01), 싸이클로스포린 처치 당뇨군에서는 이러한 P-cadherin의 발현 감소가 의미있게 억제되었다 (p<0.05).4. 사구체내 TGF-β1 mRNA와 단백의 발현은 당뇨군에서 대조군에 비해 각각 2.1배, 1.7배 증가되었으며, 싸이클로스포린 처치 당뇨군에서는 이러한 TGF-β1의 발현 증가가 의의있게 억제되었다 (p<0.05).5. 면역형광 염색 결과 사구체내 P-cadherin 단백의 발현은 족세포에 국한되었고, 대조군에 비해 당뇨군에서 유의하게 감소되어 있었으며 (p<0.05), 싸이클로스포린 처치 당뇨군에서는 P-cadherin 단백의 감소가 의미있게 회복되었다.6. Calcineurin A-α mRNA와 단백의 발현은 정상 포도당군에 비해 고포도당으로 자극한 족세포군에서 각각 2.2배, 1.8배 증가되었으며, TGF-β1을 처치한 정상 포도당군에서도 각각 2.3배, 1.7배 증가되었다 (p<0.05). 이에 반해 calcineurin A-β 발현은 모든 군 간에 유의한 차이가 없었다.7. 고포도당은 배양 족세포의 P-cadherin mRNA와 단백 발현을 각각 50.4%, 66.4% 감소시켰으며, TGF-β1으로 처치한 족세포군에서도 정상 포도당군에 비해 각각 49.3%, 67.5% 감소되었다 (p<0.05). 고포도당+싸이클로스포린 처치군에서는 P-cadherin mRNA와 단백 발현의 감소가 의미있게 억제되었다 (p<0.05).8. TGF-β1 mRNA와 단백의 발현은 고포도당군에서 정상 포도당군에 비해 각각 2.4배, 1.8배 증가되었으며, 고포도당+싸이클로스포린 처치군에서는 이러한 TGF-β1의 발현 증가가 의의있게 억제되었다 (p<0.05).결 론: 이상의 결과로, 싸이클로스포린은 당뇨 백서에서 뇨알부민 배설을 유의하게 감소시켰으며, 이러한 효과는 P-cadherin의 발현 변화와 밀접한 관련이 있을 것으로 사료된다. 또한, 싸이클로스포린에 의한 P-cadherin 발현 감소의 회복은 당뇨 조건 하에서 관찰되는 TGF-β1의 발현 증가가 싸이클로스포린에 의해 억제되기 때문으로 생각된다.

[영문]Background: Proteinuria is a clinical characteristic of diabetic nephropathy. The underlying pathologic change responsible for proteinuria is the loss of size-selective and/or charge-selective properties of the glomerular filtration barrier. Size-selectivity is maintained primarily by the slit diaphragm and P-cadherin is known as one of the basic components of it. Cyclosporin A (CsA) has been used in the treatment of various glomerular diseases with proteinuria. However, its mechanism of action has not been fully understood. I investigated whether CsA had the anti-proteinuric effect in diabetic rats and whether it was associated with the alteration of P-cadherin expression. In addition, I evaluated the role of TGF-β1, which is known to be an upstream activator of calcineurin expression in rat mesangial cells, on P-cadherin expression in cultured podocytes exposed to high glucose medium.Methods: In vivo, twenty-four Sprague-Dawley rats were injected with diluent (Control, C, N=8) or streptozotocin intraperitoneally. The latter were left untreated (DM, N=8) or treated with 1.5 mg/kg/day CsA (DM+CsA, N=8) for 6 weeks. In vitro, immortalized mouse podocytes were cultured in media with 5.6 mM glucose (LG), LG+24.4 mM mannitol (LG+M), LG+10-8 M CsA (LG+CsA), LG+10 ng/ml TGF-β1 (LG+TGF-β1), 30 mM glucose (HG), or HG+10-8 M CsA (HG+CsA). RT-PCR and Western blot were performed for P-cadherin and TGF-β1 mRNA and protein expression, respectively, with sieved glomeruli and cell lysates, and immunofluorescence staining for P-cadherin with renal tissue.Results:1. Twenty-four hour urinary albumin excretion at 6 weeks was significantly higher in DM (1.28±0.11 mg/day, p<0.05) compared with C rats (0.32 ± 0.02 mg), and CsA treatment inhibited the increase in albuminuria in DM rats (0.62±0.18 mg/day, p<0.05).2. Glomerular calcineurin A-α mRNA and protein expression in DM were 2.1-fold and 2.2-fold higher than C rats, respectively (p<0.05). On the other hand, there were no significant differences in calcineurin A-β mRNA and protein expression between the two groups.3. Glomerular P-cadherin mRNA and protein expression in DM were decreased by 40.2% and 56.1% (p<0.01), respectively, compared with C rats, and these decreases were significantly inhibited by CsA (p<0.05).4. Glomerular TGF-β1 mRNA and protein expression in DM were 2.1-fold and 1.7-fold higher than C rats, respectively (p<0.05), and CsA treatment inhibited the increases in TGF-β1 mRNA and protein expression in DM rats by 56.3% and 76.1%, respectively (p<0.05).5. Immunofluorescence staining for P-cadherin revealed a significant decrease in glomerular P-cadherin expression in DM rats (p<0.01), and this decrease was ameliorated by CsA (p<0.05).6. Calcineurin A-α mRNA and protein expression in HG podocytes were 2.2-fold and 1.8-fold higher than LG cells, respectively (p<0.05). On the other hand, there were no significant differences in calcineurin A-β mRNA and protein expression between the two groups.7. P-cadherin mRNA and protein expression in HG podocytes were 50.4% and 66.4% lower than LG cells, respectively (p<0.05), and these HG-induced decrements in P-cadherin mRNA and protein expression were restored by CsA (p<0.05).8. LG podocytes treated with TGF-β1 showed similar changes in P-cadherin mRNA and protein expression as cells cultured under HG medium.9. TGF-β1 mRNA and protein expression were 2.4-fold and 1.8-fold higher in HG podocytes compared with LG cells (p<0.05), and the increases in TGF-β1 mRNA and protein expression in HG podocytes were inhibited by 61.2% and 77.9%, respectively, with CsA treatment (p<0.05).Conclusion: I demonstrate for the first time that CsA treatment decreases urinary albumin excretion in 6-weeks DM rats and the decrease in P-cadherin expression in diabetic glomeruli and in HG podocytes is ameliorated by CsA. It suggests that anti-proteinuric effect of CsA may be associated with the alteration of P-cadherin expression in early diabetic nephropathy. In addition, inhibition of the increase in TGF-β1 expression under diabetic conditions by CsA seems to restore the P-cadherin expression, resulting in the decrease in albuminuria.