제대혈 유래 CD34 양성세포로부터 적혈구 분화유도와 microarray를 이용한 유전자 발현변화 분석

Abstract

[한글]

적혈구는 골수의 조혈모세포에서 여러 단계를 거쳐 생성되며, erythropoietin (EPO)은 적혈구 생성에서 가장 중요한 성장인자로 알려져 있다. 대부분의 적혈구 분화를 위한 시험관내 배양은 EPO를 첨가하지 않고 조혈모세포의 증식을 촉진하는 단계와 EPO의 자극을 통해 적혈구 분화를 유도하는 단계로 구성된다. 따라서 본 연구에서는 제대혈 유래 조혈모세포로부터 적혈구로 분화시키는 과정에서 EPO를 첨가하는 시기와 농도를 달리하여 첨가하는 방법을 통해 RBC 분화에 미치는 EPO의 효과를 평가하였으며, 연구의 최종목표는 제대혈 유래 CD34 양성 세포로부터 적혈구 분화를 유도하고자 하였다.건강한 산모의 제대혈에서 Ficoll-Hypaque 및 MACS system을 이용하여 CD34 양성세포를 분리하였으며, 배양은 여러 성장인자의 조합을 달리하여 세 단계로 총 21일간 진행하였다. 배양 첫 1주간은 stem cell factor, Flt-3 ligand, thrombopoietin을 첨가한 배지에서 CD34 양성세포의 증폭을 유도하였으며, EPO는 배양 8일부터 21까지 3 U/mL의 농도로 첨가하였다. 또한 EPO의 농도에 따른 효과를 알아보기 위하여 배양 초기부터 EPO를 0, 3, 10 그리고 20 U/mL의 농도로 첨가하여 배양을 진행하였다. 배양기간 동안 세포의 수와 형태를 관찰하였고 유세포분석기를 이용하여 CD34, CD38, CD45, glycophorin A (GPA)의 표현변화를 측정하였다. 또한 분화과정에서 유전자의 변화를 알아보기 위해서 high density microarray 방법을 이용하여 유전자의 발현 정도를 분석하였다.세포증식은 모든 배양 조건에서 배양 14일에 가장 높았고 그 이후 감소하기 시작하였다. EPO 농도에 따른 배양 효과를 비교하였을 때, EPO를 20 U/mL 농도로 첨가한 경우에서 세포수가 가장 많이 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 그러나 3주 배양 시 유핵 적혈구 및 적혈구의 전형적인 세포는 거의 관찰되지 않았으며 유핵세포에서의 GPA의 표현도 낮게 측정되었다. Microarray 분석에서 false detection rate (FDR)이 0.74%인 유전자는 총 125개였다. 이중 배양 7일에 비해 14일에서 그 발현이 3배 이상 증가한 유전자가 17개 있었으나, 적혈구 분화와는 상관성이 낮은 유전자였다. 그러나 적혈구 분화와 관련이 높은 유전자 항목을 개별적으로 분석한 결과 glycophorin A, Rhesus blood group CcEe antigens, erythrocyte membrane protein band 4.2 그리고 erythropoietin receptor 유전자의 발현이 배양이 진행되면서 증가함을 알 수 있었다.결론적으로 조혈모세포로부터 적혈구를 생산하고자 할 경우 EPO의 농도와 세포 증식간에는 양의 상관성이 있었다. 또한 배양 초기부터 EPO를 첨가하는 경우에서 더 많은 세포수가 증가하여 EPO를 후기 배양에 첨가하는 기존 방법보다 우수한 것으로 생각되었다. 그러나 3주 배양이 진행되는 과정에서 적혈구 분화에 관련된 유전자들의 발현은 증가하였으나 배양세포의 형태나 표현형 분석 결과 적혈구 계열 세포보다는 다른 계열 세포로의 분화가 더 많이 관찰되었다. 따라서 적혈구 분화배양의 순수도를 높이기 위하여 성장인자 조합 외에도 미세 환경 조성과 조혈모세포와 보급세포와의 상호작용 등 적혈구 분화에 미치는 요소에 대한 연구가 더 필요할 것으로 생각된다.

[영문]RBCs are produced by erythropoiesis in the bone marrow with a help of erythropoietin (EPO), which is a key factor for RBCs production. For Ex vivo generation of RBCs, a lot of studies used sequential culture protocols, which were consisted of the expansion period without EPO and the differentiation period with EPO. In this study, we have tried to generate RBC from CD34+ cells in cord blood using 3 steps culture protocol and also evaluated the changes in immunophenotypic characteristics and genetic profiles according to EPO concentration and culture duration.Using mini-MACS columns, CD34+ cells were isolated from cord blood. The culture procedure comprised three steps. For each step, cells were cultured sequentially for 7 days in a serum free liquid medium with specific combinations of growth factors for 21 days. [1st step: Flt3-ligand (Flt3-L), thormbopoietin (TPO) and stem cell factor (SCF); 2nd step: IGF-1, SCF, EPO; 3rd step: IGF-1, EPO] To evaluate the EPO effect on proliferation and differentiation, cells were cultured with three different EPO concentrations (0, 3, 10 & 20 U/mL). Cell count and morphology were monitored during this period. For phenotyping, antibodies to CD34, CD38, CD45 and glycophorin A (GPA) were used and phenotype analyses were performed on an EPICS XL. The genetic profile of cultured cells was analyzed by 17,000-gene microarray analysis.As erythropoietin concentration increased, cell expansion was also increased, showing a maximum expansion at 20 U/ml (233-fold amplification). The cell population showed a gradual decrease in expression of CD34 and CD45 whereas the expression of GPA was not prominent in any conditions (less than 3%). Through the SAM (significant analysis of microarray), 125 genes that showed significant results were selected. When we analyzed genes associated with erythropoiesis, we observed increased expression in glycophorin A, rhesus blood group, CcEe antigens, erythrocyte membrane protein band 4.2 and erythropoietin receptor gene as cultures progressed.Our study shows that erythropoietin enhance a proliferation of hematopoietic progenitor cells as well as a differentiation to erythroid lineage. Our culture system did not achieve pure production of RBCs, but induced genetic changes that indicated erythroid differentiation.