파골세포 분화에 관여하는 G 단백의 활성화

Abstract

[한글]

분화된 파골세포는 뼈에서 칼슘을 재 흡수하여 혈장내의 칼슘농도를 유지시켜 뼈를 재구성 하게 된다. RANKL (receptor activator of NF-kB ligand), tumor necrosis factor α 등의 싸이토카인은 전구세포로부터 파골세포 분화를 유도한다. RANKL 신호는 전구세포내 TRAF6를 시작으로 NFκB, c-fos, JNK, 그리고 ERK와 같은 다양한 신호전달기전을 활성화시키는 것으로 알려져 있다. 최근 전구세포 내에서 RANKL로 분화과정을 유발 시 세포내 칼슘 농도의 주기적 변화가 관찰 되었으며, 칼슘 신호가 NFATc1 (nuclear factor of activated T cell)의 활성을 조절함으로써 최종적인 분화 단계에 관여함이 밝혀졌다. 칼슘신호전달은 세포의 증식, 분화, 유전자 전사, 신경전달물질의 분비, 기억과 학습, 그리고 근수축 등과 같은 다양한 생명현상에 관여하며, 파골세포 분화과정에서도 칼슘신호 역시 중요한 역할을 수행하고 있다. 그런데 파골세포 분화과정에서 칼슘 신호는 phospholipase Cγ의 활성화와 연계되어 있는 것으로 알려져 있는 반면, G-단백 연계 칼슘신호와의 상관성은 알려져 있지 않다. 이에 본 연구에서는 G-단백을 활성화시켰을 때 파골세포로의 분화를 유도할 수 있는 지와 이에 따른 세포내 신호전달 기전을 알아보고자 하였다.파골세포 전구세포주인 RAW264.7 세포에서 칼슘 dye인 fura2의 형광정도를 세포내 칼슘농도로 간주하여 측정하였으며, G-단백을 활성화하기 위하여 aluminium fluoride (AlF4-)를 사용하였다. NFATc1의 발현과 활성도를 NFATc1 항체를 이용하여 면역반응법과 면역형광염색법으로 확인하였고, RANKL에 의한 세포내 신호전달 매개체인 ERK와 JNK의 활성도를 시간대에 따라 확인하였다.파골세포 전구체에 RANKL 자극 없이 AlF4- (100nM AlCl3, 5mM NaF)의 처리만으로 RANKL에 의한 분화과정에서 발견할 수 있는 칼슘 oscillations가 생성됨을 확인하였다. 또한 이렇게 칼슘 신호의 변화가 일어난 전구 세포들에서 tartrate resistant acidic phosphatase 염색에 대해 양성 반응을 확인함으로써, 파골세포로의 분화가 이루어짐을 알 수 있었다. 또한 최종 분화단계에 관여하는 NFATc1의 발현 증가와 핵내의 이동을 확인하였다. 아울러 G 단백 신호 활성화와 칼숨신호 전달 외에 ERK와 JNK 신호 전달 체계를 활성화 할 수 있음을 확인하였다.이상의 결과는 기존에 알려진 RANKL 신호전달 경로 외에 G 단백 신호전달 경로가 파골세포 분화과정에 관여하고 있을 가능성을 보여주고 있다고 판단된다.

[영문]To obtain consistency of Ca2+ level in blood plasma, differentiated osteoclast reabsorbs Ca2+ from bone and remodels bone structure. RANKL (receptor activator of NF-κB ligand), tumor necrois factor α and other cytokines induce osteoclastogenesis from pre-osteoclast. RANKL signal is known as an activator of TRAF6 in preosteoclast, which leads to activate NFκB, c-fos, JNK, ERK and other mechanism of signal transductions. In a recent study, intracelullar concentration of Ca2+ ([Ca2+]i) oscillations are observed during the osteoclastogenesis from pre-osteoclasts by RANKL, and NFATc1 (nuclear factor of activated T cell) activation, affected by calcium signaling, is proven as an important factor at the final stage of osteoclastogenesis. The Ca2+ signaling is involved in proliferation, differentiation, gene transcription, secretion of neurotransmitter, memory, learning, muscular contraction, and most of all osteoclastogenesis. During the osteoclastogenesis, even though phospholipase Cγ is well known activator of Ca2+ signaling, G protein-mediated Ca2+ signaling is not that well known. This research shows when G protein was activated whether osteoclastogeneis occurred.In RAW264.7, a pre-osteoclast cell line, we measured intensity of fluorescent regarding as a concentration of Ca2+, and use aluminum fluoride (AlF4-) to activate G protein. We conformed both expression and activity of NFATc1 by western blot and immunofluorescence using NFATc1 antibody, and observed activation of ERK and JNK in which are mediations of signaling in cell.Without stimulation of RANKL, Ca2+ oscillations occurred in pre-osteoclasts by AlF4-, and we conformed osteoclastogenesis by staining of tartrate resistantacidic phosphatase of these precursors. We observed NFATc1 movement in nucleus and increase of expression of NFATc1, an activator of the final osteoclastogenesis. It is proven that NFATc1 activates G protein signaling, calcium signaling, ERK and JNK signaling.In addition to previous study, RANKL signal pathway, in this research G protein signaling also affects osteoclastogenesis.