재조합항원을 이용한 폐흡충증의 면역 진단법 개발

Abstract

[한글]

폐흡충 감염에 대한 진단은 기생충학적 검사법외에 면역진단법이 유용하다. 폐흡충 항원 중 교차반응이 매우 적으며 민감도가 높은 새로운 항원을 찾고, 이에 대한 재조합 단백질을 제조하여 효소면역진단법에 적용하고자 하였다. 폐흡충 cDNA library를 immunoscreening하여 폐흡충 양성 혈청과 강하게 반응하는 항원성이 높은 클론 6개 중 2개 클론이 중요한 사람 기생 흡충인 만손주혈흡충 (Schistosoma mansoni, GenBank accession number A54521)과 일본주혈흡충 (S. japonicum, AAW25328)의 40k major egg antigen과 59% 와 63%의 유사성을 가지는 유전자이었고, 이를 폐흡충 major egg antigen로 명명하였다. 폐흡충 major egg antigen (GenBank accession number AY526873) 유전자는 322의 아미노산을 암호하는 966 bp의 open reading frame을 가지고 있었으며, 분자량은 37,276.82 Da이였다. 간접형광항체법을 수행하여 폐흡충 성충 내 major egg antigen의 분포를 알아본 결과 충란에만 분포하는 것으로 나타났다. Major egg antigen 유전자를 재조합 단백질로 과발현을 유도한 후 Ni-친화성 크로마토그라피를 수행하여 2.03 ㎎ (1.015 ㎎/㎖)의 재조합 단백질을 분리하였다.폐흡충 재조합 major egg antigen의 항원성과 교차반응성을 알아보기 위해 immunoblotting을 수행한 결과, 20명의 폐흡충 양성 혈청 중 17명인 85%가 재조합 major egg antigen에 대한 양성 band를 보인 반면, 20명의 간흡충 양성 혈청 및 3명의 정상 혈청 모두 음성으로 나타났다. 또한 폐흡충증 혈청학적 진단에의 특이도와 민감도를 알아보기 위해, 폐흡충 양성 혈청(n=41), 간흡충 양성 혈청(32), 요코가와흡충 양성 혈청(17), 유구낭미충증 양성 혈청 (38), 고충증 양성 혈청 (23)과 정상 혈청 (30)으로 효소면역진단법을 수행하였다. 30명의 정상 혈청의 흡광도를 토대로 얻은 양성 판정을 위한 cut-off 수치는 0.24 (평균 + 10 SD)였으며, 41 명의 폐흡충 양성 혈청 중, 37 혈청이 양성이었다(90.2%의 민감도). 그 외 간흡충 양성 혈청(32), 요코가와흡충 양성 혈청(17), 유구낭미충증 양성 혈청 (38), 고충증 양성 혈청 (23)들은 모두 음성이었다(100%의 특이도). 이 결과는 재조합 major egg antigen을 이용한 효소면역진단법이 높은 특이도 및 민감도로 폐흡충증 면역 진단에 매우 유용할 것으로 사료된다.

[영문]Diagnosis of paragonimiasis can be done by immunological technique as well as parasitological exam. A recombinant protein of a Paragonimus westermani major egg antigen was produced and tested as an antigen for the serologic diagnosis of P. westermani infection. The P. westermani major egg antigen gene contains a single open reading frame of 966 base pairs encoding 322 amino acids from 5'' methionine to the 3'' stop codon. The predicted amino acid sequence this major egg antigen was 59 and was 63% identical to 40k major egg antigen from Schistosoma japonicum and Schistosoma mansoni, respectively. Western blot analysis showed that sera from patients infected with P. westermani strongly reacted with the recombinant protein. The distribution of this antigen was investigated in adult worms by indirect immunofluorescence assay, and found to be distributed in eggs.The specificity and sensitivity of the recombinant antigen were assessed by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using sera from patients infected with different parasites, which included 41 patients with paragonimiasis, and negative controls. The sensitivity of ELISA using the recombinant antigen was 90.2%, and its specificity 100%. Our results suggest that the developed recombinant major egg antigen based ELISA offers a highly sensitive and specific assay for the diagnosis of paragonimiasis.