Regucalcin(SMP30)의 백서 심장에서의 발현변화 및 저산소성 심근세포에서의 칼슘 항상성 조절기능

Abstract

[한글]

Regucalcin (SMP30)은 칼슘 결합 단백질로서 칼슘의 세포내 유입을 차단하여 세포의 사멸을 억제하며, 조직의 성숙 단계에서 높게 발현되나 노화단계에서 그 발현이 감소하는 것으로 알려져 있다. 현재까지, regucalcin의 기능은 주로 간세포와 신장관 표피 세포에서 많은 연구가 이루어졌으나, 심장에서의 작용기작은 알려져 있지 않았다. 본 연구에서는 백서의 일령 변화에 따른 심장에서의 regucalcin 발현 변화와 저산소 조건으로 유발되는 심근세포사멸 기작에서 regucalcin의 역할을 조사하였다. 백서의 심장에서 regucalcin의 발현은 신생 단계에서부터 생육 일수가 증가함에 따라 증가하다가 7일째에 신생 1일째 발현량의 10배 정도로 최대 발현량을 나타내었으며, 이후로 감소하였다. 심근세포를 저산소 조건에서 24시간 동안 처리했을 때, 활성 산소종의 생성은 약 4배 정도 증가하였으나, regucalcin의 발현은 변화가 없었다. 그러나, regucalcin을 과발현할 수 있는 벡터를 심근세포에 도입한 경우, 저산소 조건에서 활성 산소종의 생성이 regucalcin 유전자를 도입하지 않은 경우에 비해 60% 정도 현저하게 감소하였다. 세포내 칼슘 농도도 저산소 조건에서 7배 이상 증가하였으나, regucalcin을 과발현 하도록 유전자를 도입한 세포에서는 과부하된 칼슘의 양이 감소되었다. 또한, 활성 산소종인 H2O2로 유발된 세포사멸에서 regucalcin을 도입은 사멸 정도를 현저하게 감소하여 세포의 생육을 크게 보완되었다. Regucalcin을 도입한 세포를 처리저산소 조건으로 처리한 경우, 저산소로 인한 PKC, ERK, 및 MEK1/2의 인산화 감소를 회복하였으나, Ras 단백질은 regucalcin 유전자의 도입과 상관없이 저산소 처리에서도 아무런 변화를 보이지 않았다. Regucalcin에 의한 원 종양 유전자 발현은 c-myc만이 영향을 받으며, elk-1과 c-fos는 영향을 받지 않는 것을 확인하였다. Regucalcin을 도입한 심근세포에서는 저산소 조건에서 caspase-3의 활성이 도입하지 않은 세포에 비해 50% 이상 현저히 감소하였으며, Bcl2/Bax의 비율도 증가하였다. JNK의 전체 발현량은 동일하지만, 인산화 형태는 감소시킴을 확인하였다. 본 연구의 결과들은 regucalcin의 심장에서의 발현이 일령에 따라 증가하다 감소함을 보여주었으며, 칼슘의 세포내 유입을 조절하므로서 심근세포의 사멸을 억제하는 생존요인으로 작용할 수 있음을 보여주었다.

[영문]Expression of regucalcin (SMP30) is maintained at a high level throughout the tissue maturation process but is dramatically decreased during senescent stages. It is known that regucalcin is a Ca2+-binding protein and could rescue cells from cell death caused by calcium influx. Regucalcin has been proposed to be involved in the maintenance of intracellular Ca2+ pump enzymes in the plasma membrane and microsomes of liver and renal cortex cells. However, the roles of regucalcin in heart were not elucidated yet. In this study, the expression levels of regucalcin were primarily measured in hearts of rats from the neonatal to the senescent stages of life. Its roles were also estimated in death process induced by hypoxia in cardiomyocytes. Although expression levels of regucalcin were gradually increased from neonatal stage to 7 day-age (about 10 folds), its expression was decreased with age. The generation of reactive oxygen species (ROS) was increased to 4-folds in cardiomyocytes under hypoxia but expression of regucalcin was not changed. However, overexpression of regucalcin significantly decreased the generation of ROS in hypoxic cardiomyocytes. Besides, transfection of regucalcin displayed suppressive effect on increase of cellular [Ca2+] at hypoxic condition and H2O2-induced cell death was significantly reduced in regucalcin-transfected cardiomyocytes. Viability of regucalcin-transfected cardiomyocytes was also increased at hypoxic conditions. Overexpression of regucalcin significantly increased the phosphorylation of PKC, ERK, MEK1/2 compared with non-transfected cardiomyocytes at hypoxic conditions, but expression of ras protein was not changed regardless of transfection of regucalcin. At hypoxic conditions, regucalcin-transfected cardiomyocytes displayed increase of Bcl2/Bax ratio and reduction of JNK phosphorylation, compared to cardiomyocytes only. Caspase-3 activity was also reduced in regucalcin-transfected cardiomyocytes at hypoxic conditions. Proto-oncogene, expression of c-myc only was affected by regucalcin, but elk-1 and c-fos were not affected. These results indicate that the expression of regucalcin in heart was increased in order to ages, but decreased in senescent stages and regucalcin could rescue cells from cell death caused by calcium influx in heart.