PTD 을 이용한 heat shock protein 70 의 전이가 골수 간엽 줄기세포의 생존에 미치는 영향

Abstract

[한글]

손상된 심근에 성인의 골수에서 유래한 간엽 줄기세포의 이식은 심부전 치료에 대한 잠재성을 가지고 있으나, 생체에 이식된 줄기 세포의 생존율이 매우 낮아 이들 세포에 의한 손상된 심근의 치료 효과는 제한적이다. 본 연구에서는 ex vivo 에서 PTD (Protein Transduction Domain) 에 Hsp70 단백질을 융합한 다음, in vivo 와 in vitro 의 저 산소 상태에서 이식될 골수 간엽 줄기세포의 생존율을 증가시키기 위해 이 융합 단백질을 골수 간엽 줄기세포에 도입하여 생존율을 확인하였다. 골수로부터 분리된 간엽 줄기 세포는 배양한지 2주 후에 섬유 아세포와 비슷한 표현형을 가진 군집을 형성했고 95% 이상이 CD71 을 발현하였다. PTD-Hsp70 융합 단백질은 TAT-HA plasmid 에 Hsp70 유전자를 재조합하고 E. coli 에서 발현시켜 생산하였다. TAT-Hsp70 융합 단백질을 도입한 골수 간엽 줄기세포는 대조군으로 사용한 골수 간엽 줄기세포에 비해 저 산소 상태에서 24시간이 지난 뒤에 더 높은 생존율을 보였고 융합 단백질의 처리 농도를 1μM 까지 증가시킴에 따라 생존율도 같이 증가하였다. 저 산소 조건하에서 Hsp70 이 도입된 골수 간엽 줄기세포는 대조군에 비해 Bcl2/Bax 의 비가 증가하였고 JNK 의 인산화가 감소하였으며 Caspase-3 활성이 감소하였다. 또한 골수 간엽줄기 세포 내 Hsp70 의 도입은 저 산소 조건하에서 세포 내 ATP 고갈에 대한 억제 효과를 보여주었다. PTD-Hsp70 을 도입한 골수 간엽 줄기세포를 쥐의 심근경색 부위에 이식한 4일 후 세포 생존율을 확인한 결과, 골수 간엽 줄기세포만을 이식한 대조군에 비해 세포 생존율이 60% 정도 향상 되었으며, 이들 생존한 세포들에서 4주 후에는 심근표지인자인 Cardiac Troponin T 및 Cav 2.1 의 발현이 관찰되었다. 이 연구는 골수 간엽 줄기세포에 도입된 Hsp70 이 in vivo 와 in vitro 에서의 저 산소 조건에서 세포의 생존성을 증가시킴을 보여주었고 이러한 실험결과는 심근 경색과 말기 심부전 환자의 세포치료법에서 이식 후 세포의 생존율은 증가시킬 수 있는 유용한 단백질을 도입할 수 있는 새로운 근거를 확보함으로써 세포치료법의 효과를 향상시킬 수 있는 유용한 수단을 제시하였다.

[영문]Transplantation of adult bone marrow-derived mesenchymal stem cell (MSC) has the potential to treat the cardiac repair following myocardial injury. However, poor cell viability after transplantation has limited the regenerative capacity of these cells in vivo. In this study, wetransduced heat shock protein (Hsp) 70 into mesenchymal stem cells using Hsp70 fused protein transduction domain (PTD) TAT ex vivo to enhance survival of these cells at the hypoxic conditions in vitro and in vivo. After 2 week culture, MSCs formed colonies with fibroblast-like morphology over 95% expressed CD71. Recombinant Hsp70-TAT fusion protein was generated by recombination Hsp70 gene with TAT-HA plasmid. Hsp70-TAT fusion protein treated MSCs displayed higher viability than that of control MSCs after 24hrs hypoxia and it was increased dose dependently up to 1uM. At hypoxic conditions, Hsp70 transduced MSCs displayed increase of Bcl2/Bax ratio and reduction of JNK phosphorylation, compared to MSCs only. Caspase-3 activity was reduced in Hsp70 transduced MSCs at hypoxic conditions. Besides, Hsp70 transduction displayed suppressive effect on cellular ATP depletion at hypoxic condition. And Hsp70 transduced MSCs showed enhanced cell viability after transplantation to infracted rat myocardium.Our studies indicate that Hsp70 transduced MSCs enhance cell viability at hypoxic condition in vitro and in vivo. These data may also provide protein transduction of MSCs with a PTD before transplantation as novel therapeutic rationales for the treatment of myocardial infarction and end-stage cardiac failure