Relaxin, Decorin, IL-12 및 B7.1 유전자들을 도입한 E1-돌연변이 복제 가능 아데노바이러스들의 항종양 효과

Abstract

[한글]

아데노바이러스를 이용한 초기의 유전자치료는 복제 불능 아데노바이러스를 주로 이용하였는데, 이들 아데노바이러스는 감염된 세포들과 그 주변에서만 제한적으로 항종양 효과를 유도하여 임상적인 실용성 면에서 많은 제약이 있다. 이를 개선하기 위해 암세포에서만 선택적으로 증식하여 암세포를 살상하는 종양 특이적 살상 아데노바이러스가 개발되어 그 유용성과 안전성이 임상시험에서 확인되었지만, 국소적으로 종양내 투여된 바이러스가 일부 주변으로만 제한적으로 확산되고 종양 조직 전체에 퍼지지 못하여 결과적으로 바이러스에 감염되지 않은 종양 세포가 다시 빠르게 성장하여 만족할 만한 치료효과를 얻지 못하였다. 따라서 우수한 세포 살상능 뿐만 아니라 종양 조직 전체에 잘 확산되어 암세포들을 효율적으로 감염할 수 있는 개선된 종양 치료용 아데노바이러스의 개발이 시급한 실정이다.

따라서 본 연구에서는, 세포외기질의 분해를 유도할 수 있는 relaxin과 decorin을 암세포 특이적으로 고 발현시켜 기존의 종양 특이적 살상 아데노바이러스가 가진 국부적 항암 효과의 한계를 개선하기 위해서, 먼저 LacZ 유전자를 발현하고 동시에 relaxin 또는 decorin을 발현하는 dl-LacZ-RLX과 dl-LacZ-DCN 복제 불능 아데노바이러스를 제작한 뒤, 종양구 조직을 배양하여 조직내 바이러스의 확산 정도를 관찰하였다. 그 결과, dl-LacZ-RLX 또는 dl-LacZ-DCN 아데노바이러스에 의한 유전자 전달 효율이 대조군 아데노바이러스인 dl-LacZ에 비해 현저히 증가하였으며, 종양구 표면뿐만 아니라 종양구 안쪽까지 LacZ가 발현되어 아데노바이러스가 종양구 조직내로 활발히 확산되어 나간 것을 확인하였다. 생체내 암조직에서도 dl-LacZ-RLX, 또는 dl-LacZ-DCN 아데노바이러스가 투여부위로부터 더 멀리 그리고 더 넓게 퍼져나간 것을 다시 한 번 확인할 수 있었다. 이러한 relaxin의 현저한 조직내 바이러스 확산 증진 효과가 종양 특이적 살상 아데노바이러스에도 적용되어, 그 결과 항종양 효과가 증대될 수 있는지를 알아보기 위해서, relaxin과 decorin을 발현하는 Ad-ΔE1B-RLX과 Ad-ΔE1B-DCN 종양 특이적 살상 아데노바이러스를 각각 제작하였다. Ad-ΔE1B-RLX과 Ad-ΔE1B-DCN 아데노바이러스의 인접한 세포로의 증가된 바이러스 확산으로 plaque의 형성이 빠르게 진행되었으며, 세포 살상능도 약 2～10배 정도 증가함을 관찰하였다. 이러한 Ad-ΔE1B-RLX과 Ad-ΔE1B-DCN 아데노바이러스의 조직내 확산능 증대 및 세포 살상능의 증대 효과는 인체 종양 xenograft model에서 향상된 항종양 효과로 나타났다. 또한, 종양 조직을 H & E 염색, TUNEL 분석, 조직 면역학적 염색을 진행한 결과, Ad-ΔE1B-RLX 또는 Ad-ΔE1B-DCN 아데노바이러스를 투여한 부위인 종양의 가장자리에서 아데노바이러스가 다량 검출 되었으며, 동시에 세포고사 및 세포괴사도 유도 되었음을 확인하였다.

암을 면역학적으로 연구하려는 시도가 최근에 활발히 진행되고 있다. 전이암처럼 국소적인 투여가 아닌 암세포 특이적 전신적 치료를 요하는 암 유전자 치료를 위하여, 종양 특이적 살상 아데노바이러스인 YKL-1에 항암 면역반응을 유도할 수 있는 IL-12와 B7.1 유전자를 도입하여 YKL-IL12와 YKL-IL12

B7을 각각 제작하였다. C57BL/6 마우스에 형성된 B16-F10 흑색종에 YKL-IL12/B를 투여한 경우, CD4+와 CD8+ T 세포 및 splenic dendritic cell(DC)의 군집 비율이 대조군인 YKL-1이나 YKL-IL12을 투여한 경우에 비하여 현저히 증가하였으며, 생체내 항종양 효과도 크게 증가하였다. 또한, 종양 특이적 독성 T 세포의 활성화를 분석할 수 있는 cytotoxic T lymphocyte(CTL) assay와 enzyme-linked immune spot(ELISpot) assay을 시행한 결과, 종양 항원 특이적 T-세포 매개 세포살상에 의하여 항종양 효과가 개선되었음을 알 수 있었다. 이와 더불어, YKL-IL12과 YKL-IL12/B 치료군에서 종양 조직의 괴사가 두드러지게 관찰되었고, PBS와 YKL-1 대조군에 비하여 종양 조직 내로의 CD4+와 CD8+ T 세포의 침윤이 크게 증가하였다.

결과적으로, 본 연구자는 종양 특이적 살상 아데노바이러스의 암조직내 확산을 향상시키고 또한 인체 면역체계의 활성화를 유도하여 암유전자 치료의 실용화 방안을 정립하고자 하였다

[영문]Advancement in engineering of replicating viruses has contributed greatly in advancing cancer gene therapy, and clinical trials with such viruses are ongoing to treat a variety of cancers. An important issue that has received little attention, but is nevertheless of fundamental importance in replicating virus-based cancer gene therapy, is the limited spread of injected virus in solid tumor mass. Although replicating viruses have an improved ability to spread through a tumor compared with replication incompetent viruses, the inefficient spread of virus throughout the target tumor tissue still represents a major obstacle for effective therapeutic strategies. With the aim of improving viral spread and tumor penetration for cancer gene therapy, we have generated replication-incompetent (dl-lacZ-RLX and dl-lacZ-DCNG) and -competent (Ad-ΔE1B-RLX and Ad-ΔE1B-DCNG) adenoviruses (Ads) that express a matrix degradative proteins, relaxin (RLX) and decorin (DCN), respectively. Compared to its control, tumor spheroids transduced with dl-lacZ-RLX or dl-lacZ-DCNG showed greater tranduction efficiency and viral spread throughout the tumor mass. This enhanced gene transfer efficiency and viral spread was also evident when transduced into solid tumors in vivo, indicating that the expression of relaxin and decorin significantly enhanced viral spread and transgene expression both in vitro and in vivo. Both relaxin and decorin also successfully enhanced viral spread of replicating oncolytic adenovirus, leading to an increased anti-tumor effect. In cytopathic effect (CPE) and plaque formation assays, Ad-ΔE1B-RLX and Ad-ΔE1B-DCNG showed greater cell killing potency and shorter time to plaque formation compared to their isogenic control vector, Ad-ΔE1B. From TUNEL and fluorescence-activated cell-sorting (FACS) analysis, the mechanism by which Ad-ΔE1B-RLX and Ad-ΔE1B-DCNG elicits their effect was via induction of apoptosis. The enhanced cell killing potency of relaxin- or decorin-expressing adenovirus also translated into in vivo, as greater anti-tumor and survival advantage was observed for Ad-ΔE1B-RLX- and Ad-ΔE1B-DCNG-treated tumor-bearing mice. Viral persistence and distribution within the tumor was confirmed by immunohistohemistry, where a marked increase in number of adenoviral particles was seen throughout the tissue of Ad-ΔE1B-RLX- and Ad-ΔE1B-DCNG-treated tumors. Ad-ΔE1B-RLX and Ad-ΔE1B-DCNG also elicited enhanced apoptosis and extensive necrosis compared to those tumors from untreated or control virus-treated mice. Furthermore, Ad-ΔE1B-RLX and Ad-ΔE1B-DCNG also substantially decreased collagen content within tumor tissue, while normal tissue adjacent to tumor tissue was not affected. Taken together, these data demonstrate the utility of relaxin and decorin as dispersion agents as well as strong inducers of apoptosis, and suggest that relaxin and decorin have a great potential to improve the efficacy of replicating adenovirus-mediated cancer gene therapy.

Interleukin (IL)-12 is reported to exhibit potent anti-tumor effect by promoting NK cell and cytotoxic T cell activities. The B7 family has been shown to take an important role in stimulating anti-tumor response, and synergy between IL-12 and B7-1 for cancer immunotherapy has previously been demonstrated. To increase the potential antitumor activity of the oncolytic adenovirus, we have constructed an E1B 55kDa deleted oncolytic adenoviral vector, YKL-IL12/B, which expresses murine IL-12 and B7.1. The therapeutic efficacy of YKL-IL12 and YKL-IL12/B was evaluated in an immunocompetent mouse bearing murine melanoma B16F10 tumor. The results showed significant inhibition of tumor growth following YKL-IL12/B treatment compared to PBS treated tumors. Moreover, YKL-IL12/B adenoviral vector elicited enhanced antitumor activity and a higher incidence of complete tumor regression compared to tumors treated with the analogous vector (YKL-1) that lacks IL-12 and B7.1. Survival was also significantly prolonged in YKL-IL12/B-treated mice, and immunohistochemistry analysis demonstrated robust CD4+ and CD8+ T-cell infiltration in these mice compared to the YKL-1 subjects. In addition, we observed that YKL-IL12/B induced significantly higher CTL activity than YKL-1, demonstrating that anti-tumor effect is associated with the generation of tumor-specific immune response. In summary, these data indicate that local expression of IL-12 and B7.1 in tumor bed may be an attractive alternative treatment against metastatic carcinoma.