쥐 신경절세포주에서 α-2 아드레날린수용체 효현약물의 신경보호효과

Abstract

[한글]

(연구배경) Endoplasmic reticulum(ER) stress에 의한 세포자멸사(apoptosis)는 알쯔하이머병을 포함한 여러 퇴행성신경질환의 병인으로 주목받고 있다. 녹내장에서 발생하는 망막신경절세포의 세포자멸사도 퇴행성신경질환과 공통된 병리현상이 발견됨에 따라 망막신경절세포의 세포자멸사에도 ER stress가 관여할 가능성이 있다. 본 연구에서는 현재 사용되고 있는 녹내장 약물 중 망막신경절세포에서 신경보호효과가 있는 것으로 알려진 α-2 아드레날린수용체 효현약물인 brimonidine이 ER stress에 의해 유도된 망막신경절세포주의 세포자멸사를 억제할 수 있는지 알아보고 그 기전을 알아보고자 하였다.

(대상 및 방법) Thapsigargin 1 μM을 transformed rat retinal ganglion cell line(RGC-5 세포)에 처리하여 ER stress를 유도하였다. Thapsigargin 처리 1시간 전에 brimonidine(25 μM - 1000 μM)과 betaxolol(25 μM - 1000 μM)을 전 처치한 후 24시간 뒤에 LDH 분석과 TUNEL 염색을 시행하여 이 약물들이 thapsigargin에 의한 RGC-5 세포의 세포자멸사를 억제할 수 있는지 알아보았으며, brimonidine(100 μM) 사용 유무에 따른 caspase 12와 caspase 3, 그리고 PARP에 대한 western blot을 시행하였다. 또한, caspase 3 특이적 억제제인 z-DEVD-fmk 1 μM 처리 유무에 따라 thapsigargin을 처리한 RGC-5 세포에서 caspase 12와 caspase 3, 그리고 PARP의 발현양상을 western blot을 시행하여 확인하였다.

(결과) LDH 분석 결과 thapsigargin은 RGC-5 세포에서 세포사를 유발하였으며 세포사는 brimonidine에 의해 억제되었으나 betaxolol에 의해서는 억제되지 않았다. TUNEL 염색 결과 thapsigargin을 단독 처리한 경우와 betaxolol을 전 처치 한 경우에서는 다수의 TUNEL(+) 세포가 관찰되었으나 brimonidine을 전 처치한 경우에서는 TUNEL(+) 세포의 숫자가 감소되는 것을 확인하였다. Western blot을 시행한 결과 RGC-5 세포 내에 분절화 되지 않은 caspase 12와 caspase 3, 그리고 PARP가 관찰되었으며 thapsigargin에 의해 caspase 12와 caspase 3, 그리고 PARP의 분절화가 일어나는 것이 관찰되었다. Brimonidine은 thapsigargin에 의한 caspase 12와 PARP의 분절화를 억제하는 것이 확인되었으며, caspase 3 억제제인 z-DEVD-fmk는 thapsigargin에 의해 유도된 PARP의 분절화를 억제하였으나 caspase 12의 분절화는 억제하지 못하였다.

(결론) RGC-5 세포에서 thapsigargin에 의해 세포의 세포자멸사가 유발됨을 알 수 있으며 brimonidine에 의해 세포자멸사가 억제됨을 확인하였다. Thapsigargin에 의한 RGC-5 세포의 세포자멸사는 caspase 3와 caspase 12의 활성화가 관계되며 caspase 3의 활성화와 관계없이 capsase 12가 활성화됨을 알 수 있었다. Brimonidine은 caspase 12와 caspase 3의 활성화를 억제하여 thapsigargin에 의한 RGC-5 세포의 세포자멸사 억제에 기여하는 것으로 생각된다.

[영문](Purpose) Endoplasmic reticulum(ER) stress induced apoptosis contributes to the pathogenesis of various neurodegenerative diseases including Alzheimer''s disease. ER stress induced neurodegeneration may participate in the apoptosis of retinal ganglion cells in glaucoma, because glaucoma meets the criteria for a neurodegenerative disease. Brimonidine, an α-2 adrenergic receptor agonist, has the potential to protect neurons in glaucoma and other neurodegenerative diseases. The objective of this study is to ascertain whether brimonidine protects retinal ganglion cells from ER stress in vitro, and if so, to determine the mechanisms of the neuroprotective effects of the brimonidine in cultured transformed rat retinal ganglion cell lines (RGC-5 cells).

(Materials and methods) ER stress was induced by 1 μM of thapsigargin in cultured RGC-5 cells. A series of brimonidine(25 μM - 1000 μM), betaxolol(25 μM - 1000 μM) or vehicle solutions were administered to the RGC-5 cells 1 hour before the administration of thapsigargin (1 μM) for 24 hours. The rate and the type of RGC-5 cell death were evaluated using LDH assay and TUNEL staining. The western blot analysis to caspase 3, caspase 12, and PARP was performed in thapsigargin treated RGC-5 cells in the presence or absence of brimonidine(100 μM) or z-DEVD-fmk(1 μM), a specific caspase 3 inhibitor.

(Results) The thapsigargin-induced death of RGC-5 cells was significantly inhibited by brimonidine but not by betaxolol. Thapsigargin increased the number of TUNEL(+) cells, which was inhibited by brimonidine but not by betaxolol. The western blot analysis confirmed that thapsigargin promoted cleavage of caspase 3, caspase 12 and PARP. The analysis also confirmed that brimonidine could inhibit the thapsigargin-induced activation of caspase 12 and caspase 3 in RGC-5 cells. The thapsigargin-induced cleavage of caspase 12 in RGC-5 cells occurred even if the activation of caspase 3 was blocked by z-DEVD-fmk, a specific caspase 3 inhibitor.

(Conclusion) ER stress induced by thapsigargin caused the apoptosis of RGC-5 cells, and the thapsigargin-induced apoptosis of RGC-5 cells was blocked by brimonidine. The activation of caspase 12 and caspase 3 may contribute to the thapsigargin-induced apoptosis in RGC-5 cells. The activation of caspase 12 was thought to be uninfluenced by the activation of caspase 3. Brimonidine can inhibit the activation of caspase 12 and caspase 3 in the thapsigargin-treated RGC-5 cells, which may participate in the mechanisms involved in the neuroprotective effects of brimonidine in ER stress-induced apoptosis in retinal ganglion cells.