Relationship between the level of HIV-1 proviral DNA and HIV-1-specific cytotoxic T lymphocyte response in HIV-1 infected Koreans

Abstract

[한글]

연구배경: HIV 감염자에서 강력한 항레트로바이러스 치료(highly active antiret- roviral therapy, HAART)는 획기적으로 그 임상 경과를 호전시키는 것이 증명되었으며, AIDS 관련 사망률을 현저히 감소시켰다. 하지만 HAART로 HIV 감염을 완치시킬 수 없는데, 이는 HAART를 시행해도 proviral DNA 형태의 latent reservoir 가 존재하기 때문이다. 최근 HIV 감염을 치료하는데 있어서 숙주 면역 기능의 역할이 강조되고 있으며, HIV 특이 세포독성 T림프구 반응(cytotoxic T lymphocyte response, CTL 반응)은 HIV에 대한 숙주 면역기능 중에서 가장 중요한 역할을 한다. 연구자는 HAART를 시행해도 없어지지 않는 HIV의 reservoir를 반영한다고 알려져 있는 proviral DNA의 level이 CTL 반응에 영향을 미칠 것이라고 가정하였다. 본 연구의 목적은 한국인 HIV 감염자에서 HIV-1 proviral DNA level과 CTL 반응 간의 상관관계를 규명하는 것이다.

대상 및 방법: 연세대학교 의과대학 세브란스병원에 내원한 82명의 한국인 HIV-1 감염자를 대상으로 하였다. Sequencing based typing 방법으로 HLA I 유전형을 결정하였다. 말초혈액 단핵구로부터 human CD4 세포분리 kit를 사용하여 CD4 양성 T림프구를 분리하였다. 전체 CD4 양성 T세포 중에서 HIV-1 provirus가 있는 CD4 양성 세포의 비율을 결정하기 위하여 CD4 양성 T세포의 genomic DNA를 주형으로 real time PCR을 수행하였다. CTL response 정도를 측정하기 위하여 HLA-I 제한 peptide를 사용하여 Enzyme linked immonospot (ELISPOT) assay를 수행하였다. HIV-1 특이 CTL 반응과 HIV-1 provirus가 있는 CD4 양성 세포의 비율 간의 상관 관계는 Spearman''s rank correlation이나 Pearson''s correlation을 사용하여 검증하였다.

결과: HIV-1 provirus가 있는 CD4 양성 세포의 비율은 HAART를 시행받은 환자와 시행받지 않은 환자 간에 유의한 차이가 없었다. HIV-1 provirus가 있는 CD4 양성 세포의 비율은 CD4 양성 T세포수와 유의한 역의 상관관계를 나타냈다(P= 0.01, r=-0.307). HAART를 시행 중인 환자들에서 혈장 바이러스 농도가 검출한계 미만으로 억제되어있는 환자들에서의 HIV-1 provirus가 있는 CD4 양성 세포의 비율이 바이러스 농도가 억제되지 않은 환자보다 낮았다(P=0.033). CTL 반응은 혈장 바이러스 농도가 억제되지 않은 환자들이 혈장 바이러스 농도가 억제된 환자들보다 높았다(P=0.02). 혈장내 바이러스 농도가 억제되어 있는 HLA-A02 유전형을 지닌 환자에서 HIV-1 provirus가 있는 CD4 양성 세포의 비율과 CTL 반응은 상관 관계가 없었다(P=0.604). HLA-A*0201 유전형을 지닌 환자들 중 64.3%에서 Gag p1777-85 epitope 부위의 escape variation이 나타났다. HLA 유전형이 A02가 아닌 환자들 중 73.1%에서 Gag p1777-85 epitope 부위의 염기서열 변이가 나타났다.

결론: HAART는 기존의 연구 결과와 마찬가지로 HIV proviral DNA를 없애지 못하는 것으로 나타났다. CTL 반응은 proviral DNA에 의해서는 영향받지 않고 혈장내 바이러스억제 여부에 의해서만 영향 받는 것으로 나타났다. 대상 한국인 HIV 만성 감염자에서 면역 escape mutant가 있었다. 그러나, HLA-A*0201 유전형인 군과 HLV-A02 유전형이 아닌 군 사이의 HLA-A*0201 제한 epitope의 아미노산 염기서열을 비교해 본 결과는 면역 선택압력이 만성 HIV 감염자의 생체내에서 큰 영향을 미치지 못할 가능성이 있음을 나타냈다. HAART와 CTL 이 provirus reservoir를 없앨 수 없으므로, HIV 완치를 위한 다른 전략이 필요하다고 사료된다.

[영문]Background: The use of highly active antiretroviral therapy(HAART) in the treat- ment of human immunodeficiency virus type 1(HIV-1)-infected individuals has resulted in dramatic improvements in the clinical outcomes of many infected persons. However, HAART does not eliminate the persistently replicating, latent HIV-1 reservoir in patients, despite the viral suppression associated with the therapy. HIV-specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs) play a central role in the immune response to HIV infection. The objective of this study is to ascertain the relationship between the level of HIV-1 proviral DNA and CTL response in HIV-infected Koreans.

Patients and Methods: Eighty-two HIV-1-infected Koreans who had been admitted to Severance Hospital, Yonsei University College of Medicine, were included in this study, after obtaining their informed consents. HLA class I genes were typed, using the sequencing-based typing method. CD4+ T cells were isolated from the peripheral blood mononuclear cells(PBMC) of HIV-1-infected individuals, using a human CD4 cell-separation kit. In order to determine the frequency of CD4+ T cells carrying HIV-1 provirus in infected individuals, real-time PCR was carried out. DNA (1ng) from the CD4+ T cells was used as a template for the real-time PCR. An enzyme linked immunospot (ELISPOT) assay, using HLA-I restricted peptides, was also performed to evaluate the responses of the HIV-1-specific cytotoxic T lymphocytes. Spearman''s rank correlations or Pearson''s correlation were used to correlate the frequency of HIV-1-specific CTLs with the frequency of CD4+ T cells harboring HIV-1 proviral DNA.

Results: No significant differences in the frequency of CD4+ T cells harboring HIV-1 proviral DNA were detected between patients receiving, and those who did not receive, HAART. There was, however, a statistically significant inverse correlation between the frequency of CD4+ T cells harboring HIV-1 proviral DNA and the CD4+ T cell counts in the peripheral blood of subjects(P=0.01, r=-0.307). Among the patients receiving HAART, the frequency of CD4+ T cells harboring HIV- 1 proviral DNA was lower in patients in whom viral load had been suppressed to levels below 25copies

mL than in patients in whom viral load had not been suppressed(P=0.033). CTL response was also found to be higher in patients with unsuppressed viral loads than in patients whose viral loads had been suppressed to undetectable levels(P=0.02). In patients with the HLA-A genotype of HLA-A*0201, who also exhibited undetectable levels of plasma viral load due to suppression, the frequency of CD4+ T cells harboring HIV-1 proviral DNA did not correlate with the CTL response(P=0.604). Among the 28 patients studied with HLA-A genotype of HLA-A*0201, 18(64.3%) exhibited sequence variations in the Gag p1777-85 epitope. Among 26 patients studied with HLA-A genotype other than HLA-A02, 19(73.1%) exhibited sequence variations in the Gag p1777-85 epitope.

Conclusions: HAART does not eradicate the proviral DNA. This result is also consis- tent with the results of previous studies. CTL response was affected by plasma HIV RNA, but not by proviral DNA. There were immune escape mutants in these chronically HIV-1 infected Koreans. However, a comparison of viral sequences derived from the HLA-A*0201 positive individuals to sequences obtained from HLA-A02 negative indivi- duals demonstrated some weak evidence for immune selective pressure, thus bringing into question the in vivo efficacy of immunodominant CTL responses during chronic HIV-1 infection. As neither HAART nor HIV-1 specific CTL eradicate proviral reservoirs, another strategy is clearly required in order to eradicate HIV infection.