세로토닌이 마우스 소장 카할세포에 미치는 영향

Abstract

[한글]

세로토닌(serotonin; 5-HT)은 뇌 뿐만 아니라 장에서 중요한 신경전달물질로 작용을 한다. 최근 5-HT3 수용체의 면역반응성이 쥐 위장관에서 소화관 운동의 pace maker로 알려진 카할 세포(interstitial cells of Cajal; ICC) 등에서 발견되었지만 카할 세포에서 5-HT의 기능적인 역할은 잘 알려지지 않았다. 따라서 본 연구에서는 배양된 카할 세포에서 5-HT 수용체 활성화가 카할 세포의 막전압 및 전류의 변화와 칼슘 변화에 미치는 영향 및 그 조절 기전을 규명하고자 하였다. 카할 세포는 7～10일 된 마우스의 소장으로부터 분리하였으며, 분리된 세포들은 stem cell factor(SCF, 5 ng/ml, Sigma)가 들어있는 배지에서 하루 혹은 이틀 간 배양 후 사용하였다. 세포막전압과 전류는 whole-cell patch clamp 방법을 사용하여 기록하였으며, 칼슘 변화는 칼슘 측정 염료인 Fura-2/AM을 사용하여 기록하였다. 카할 세포의 안정막 전압은 -56.4±1.2 mV(n=33), 서파(slow wave)의 크기는 26.6±2.3 mV(n=20)였으며, pacemaking 전류의 크기는 -581±75.9 pA(n=22), 빈도는 분당 15.4±0.7 회(n=45)였다. 5-HT는 내향전류(-546.8±111.2 pA)와 막전압의 탈분극(-19.3±1.9 mV)을 유발시켰다. 5-HT에 의한 탈분극은 RS 23579-190(10 μM) 및 SDZ(20 μM)와 같은 5-HT4 수용체 차단제에 의해 차단되었으며, ondansetron(5 μM), Y25130(10 μM) 및 MDL7222(1 μM)와 같은 5-HT3 수용체 차단제에 의해서는 영향을 받지 않았다. 낮은 농도의 5-HT(0.1, 1, 10 μM)는 카할 세포의 칼슘 oscillation의 빈도를 증가시켰으며, 높은 농도의 5-HT (100 μM)에서는 칼슘 oscillaton의 소실과 기저(basal) 칼슘을 증가가 관찰되었다. 이러한 칼슘 증가는 5-HT4 수용체 효현제들(5-methoxytrypamine 및 2-[1-(4-piperonyl)piperazinyl]benzothazole)에 의해 동일하게 재현되었으며, 5-HT4 수용체 차단제에 의해 차단되었다. 5-HT 및 5-HT4 수용체 효현제에 의한 탈분극 및 칼슘의 증가는 PKA 억제제(100 nM)에 의해 차단되었다. 배양된 카할 세포에 5-HT4 수용체의 siRNA를 처치 하였을 경우, 5-HT4 수용체 효현제인 cisapride에 의한 세포막 전압의 탈분극과 내향 전류가 소실됨을 확인하였다. 이상의 결과들을 종합해 볼 때, 카할 세포에서 5-HT 수용체는 막전압을 탈분극시켰으며 이러한 5-HT 수용체의 역할은 위장관 기능 조절에 중요할 것으로 사료된다.

[영문]Serotonin (5-hydroxytryptaminel 5-HT) plays an important role in the brain as well as in the gastrointestinal (GI) tract as neuroenteric modulator. Recently, the 5-HT3 receptor immunoreactivities were found in the rat GI tract including the interstitial cells of Cajal (ICC), which is known as the pacemaker cell of the peristaltic movement. To date, however, functional roles of 5-HT receptors in the ICC had not been elucidated. Therefore, this study was performed to clarify the influences of 5-HT receptor activation on the membrane potential, membrane current and intracellular Ca2+ concentration ([Ca2+]i) together with their regulatory mechanisms in the ICC. We isolated the ICC from the small intestine of the 7~10 day-old Balb/C mouse and cultured for 1 or 2 days before using. After confirmation of pacemaking activity in the cultured ICC, we measured the membrane potential and membrane currents by using the whole-cell patch clamp technique. Changes in [Ca2+]i was measured with Fura-2/AM using fluorescence measurement system. In the ICC with pacemaking activity, resting membrane potential was 56.4±1.2 mV (n=33) and intensity of the slow wave was 26.6±2.3 mV (n=20). The amplitude of pacemaking current was 581±75.9 pA (n=22) and its frequency was 15.4+0.7 (n=45). 5-HT induced a depolarization (-19.3±1.9 mV) in the membrane potential during current clamp-mode and a prominent inward current (-546.8±111.2 pA) during voltage clamp-mode with holding at -80 mV. The 5-HT-induced depolarization was partially or completely blocked by RS23579-190 and SDZ, which are known as selective 5-HT4 receptor antagonists but not by the 5-HT3 receptor antagonists, such as ondansetron (5 μM), Y25130 (10 μM) and MDL7222 (1 μM). In Fura-2 loaded ICC, low concentrations of 5-HT (0.1 μM, 1 μM and 10 μM) increased frequency of the [Ca2+]i oscillation and itsbasal level in a concentration-dependent manner. At 100 μM of 5-HT, however, oscillation was disappeared and basal [Ca2+]i level only was continuously increased. This increase in [Ca2+]i was mimicked by 5-HT4 agonists (5-methoxytryptamine and 2-[1-(4-piperonyl)piperazinyl]benzothiazole) and blocked by 5-HT4 blockers. Myristoylated PKA inhibitor (100 nM) markedly attenuated the depolarization and [Ca2+]i changes caused by 5-HT and 5-HT4 agonists. After application of siRNA targeted against 5-HT4 receptor in the ICC, the depolarization of the membrane current and the inward current induced by 5-HT4 receptor agonist (cisapride) were disappeared. From all these results, it is concluded that 5-HT receptor induces membrane depolarization and [Ca2+]i increase in the ICC, which is responsible for the serotonergic modulation of the gastrointestinal function.