주골반 자율신경절에서 세로토닌 수용체의 특성

Abstract

[한글]

세로토닌(serotonin, 5-hydroxytryptamin, 5-HT)과 그 수용체는 중추 및 말초신경계 모두에 존재하며, 신경 활성 및 신경전달물질 유리 등의 조절에 중요한 역할을 담당한다. 또한 리간드(ligand)에 의해 활성화 되는 통로와 G-단백질과 연결된 수용체들 간의 상호 작용이 신경의 기능의 조절에 매우 중요하다. 골반 신경절은 방광, 음경 등 다양한 비뇨생식 기관의 신경 지배를 담당하며 생리적으로 배뇨나 발기 반사와 같은 중요한 기능을 조절한다. 5-HT는 골반 신경절의 일부 신경세포에 존재하며, 신경세포를 탈분극시키거나 신경절 내의 시냅스 전달을 억제한다고 알려져 있다. 하지만 현재 골반 신경절에서 5-HT의 작용기전에 관해서는 세포 및 분자 수준에서 잘 알려져 있지 않다. 따라서 본 연구에서는 첫째, 이온통로 기능을 하는 5-HT3 수용체의 특성을 확인하고, 둘째, GABAB 수용체에 의한 5-HT3 수용체 조절의 신호전달 과정을 확인하고, 셋째, G-단백질과 연결된 5-HT2 수용체를 통한 세포내 칼슘 조절 기전 중 일부를 규명하고자 하였다. 이를 위하여 수컷 쥐 주골반 신경절(major pelvic ganglia, MPG) 세포에서 패치 클램프(patch clamp)와 형광 칼슘 측정 기술을 사용하여 5-HT 수용체 활성이 막전압과 및 막전류 및 세포내 칼슘([Ca2+]i)에 미치는 효과를 관찰하였다.

역전사 중합 연쇄반응 분석으로 주골반 신경에는 5-HT1A, 5-HT1B, 5-HT2B, 5-HT3A, 5-HT3B, 및 5-HT4-7 등 다양한 5-HT 수용체가 발현되어 있음을 확인하였다. 5-HT(10 μM)는 내향성 전류를 유발하는 동시에 [Ca2+]i을 증가시켰으며, 이러한 작용들은 5-HT3 수용체 차단제인 MDL7222(1 μM)와 Y25130(10 μM)에 의해 완전히 차단되었다. GABAB 수용체의 효현제인 baclofen(10 μM)은 5-HT3에 의한 여러 반응들을 억제하였으며, GABAB 수용체 차단제인 CGP35348(10 μM)을 전처치 하였을 경우 baclofen에 의한 효과가 소실되었다. 5-HT3 수용체 활성에 의한 [Ca2+]i 증가가 adenylyl cyclase(AC) 억제제인 SQ 22536(200 μM)과 PKA 억제제(100 nM)에 의해 감소되었으며, 이러한AC/PKA 경로 차단 효과는 baclofen의 효과와 일치하였다. 한편, AC/PKA 경로 활성제인 forskolin(1 μM)은 5-HT에 의한 [Ca2+]i의 변화를 증가시켰다. 이상의 결과로부터 주골반절 신경세포에서 GABAB 수용체는 AC/PKA 의존적 경로를 통하여 5-HT3 수용체를 조절함을 알 수 있었다.

교감 및 부교감 신경세포에서 5-HT와 5-HT2B 수용체 효현제인 BW723C86(10 μM)은 [Ca2+]i 을 증가시켰으며, 이러한 증가는 5-HT2B 수용체 차단제인 SB204741(10 μM)에 의해 소실되었다. 세포외액 내에 칼슘 이온을 제거하였을 경우에는 5-HT2B 활성화에 의한 [Ca2+]i의 증가가 나타나지 않았다. 5-HT2B에 의한 [Ca2+]i 증가는 비선택적 양이온통로 차단제, Gd3+(10 μM) 및 La3+(100 μM), PLC 억제제(U73122, 1 μM)에 의해 현저히 억제되었으나, U73122의 유사체로 PLC를 억제하지 않는 U73343(1 μM) 전처치에 의해서는 영향을 받지 않았다. 막전압고정법 하에서 BW723C86(100 μM)는 내향성 전류를 유발하였으며, 유발된 전류는 La3+에 의해 완전히 차단되었다. 흥미롭게도 세포막 투과가 가능한 DAG 유사체인 OAG(100 μM)는 세포 외부로부터 칼슘 유입을 증가시켰다. 역전사 중합 연쇄반응 분석시 주골반절 신경세포에 TRPC1과 TRPC6 통로가 발현되어 있음이 확인되었다. 이상의 결과들은 5-HT2B 수용체에 연결된 Gq11-PLC-DAG 신호전달에 의해 TRPC 통로가 활성화 되어 세포내로 칼슘이 유입됨을 시사한다.

결론적으로 주골반 신경절 세포들에는 여러 종류의 5-HT 수용체들이 기능적으로 발현되어 있으며, 이들 수용체들 중 5-HT3 수용체는 주로 부교감 신경세포에서 세포내 칼슘을 증가시켜 세포막의 흥분성을 높였으며, 이러한 기능은 AC/PKA 경로를 통해 조절될 수 있음을 확인하였다. 또한 5-HT2B 수용체 활성은 교감 및 부교감 신경 세포에서 세포내 칼슘 저장고와는 무관하게 TRPC6를 통해 세포내 칼슘을 증가시켰다. 앞으로 주골반 신경절세포는 5-HT 수용체와 다른 신경전달물질의 수용체 간의 상호작용 연구나 5-HT 수용체 활성에 의해 TRPC 통로가 조절되는 메커니즘 연구에 좋은 모델이 될 것으로 사료된다.

[영문]Serotonin (5-hydroxytryptamin, 5-HT) and its receptors are found in the central and peripheral nervous systems, and play important roles in regulation of neuronal activity and transmitter release. In addition, communication between the ligand-gated channels and G protein-coupled receptors appears to provide crucial mechanisms for tuning of neuronal functions. Pelvic ganglia provides autonomic innervations to the various urogenital organs including the bladder and the penis, and thereby plays physiologically important roles in the micturition and erectile reflexes. Several studies have shown that 5-HT is present in some neurons of the pelvic ganglia, depolarizes neurons and inhibits ganglionic transmission. In pelvic ganglia, however, mechanisms underlying actions of 5-HT remain unknown. Therefore, this study was performed to examine i) characteristics of 5-HT3 receptors, ii) signalling pathways involved in GABAB-receptor mediated modulation of the 5-HT3 receptors, and iii) mechanisms underlying regulation of intracellular Ca2+ concentration ([Ca2+]i ) by Gq -coupled 5-HT2 receptor. In this regard, effects of 5-HT receptors on membrane potential, ionic currents, and [Ca2+]i were investigated using patch-clamp and fluorescence Ca2+ measurement techniques.

RT-PCR analysis revealed that MPG neurons express different subtypes of 5-HT receptors including 5-HT1A, 5-HT1B, 5-HT2B, 5-HT3A, 5-HT3B, 5-HT4, 5-HT5B, and 5-HT6/7. 5-HT (10 μM) elicited a fast inward current and simultaneous augmentation of [Ca2+]i, which were completely abolished by MDL7222 (1 μM) and Y25130 (10 μM), selective 5-HT3 receptor antagonists. Baclofen (10 μM), a selective GABAB agonist, also completely suppressed the 5-HT-induced response. As expected, this baclofen effect was prevented by CGP35348 (10 μM), a selective GABAB antagonist. Action of 5-HT3 receptor was blocked by SQ22536 (200 μM), an adenylyl cyclase inhibitor, and myristoylated PKA inhibitor (100 nM), which was mimicked baclofen. Furthermore, forskolin (1 μM) augmented the 5-HT-induced changes in [Ca2+]i. increase. Taken together, these data suggest that 5-HT3 receptor negatively couples GABAB receptor via an AC/PKA-dependent pathway in rat MPG neurons.

In both sympathetic and parasympathetic neurons, 5-HT (10 μM) itself and BW723C86 (10 μM), a 5-HT2B agonist, increased [Ca2+]i , which were prevented by SB204741 (10 μM), a 5-HT2B antagonist. This 5-HT2B-mediated [Ca2+]i increase was blocked by removal of extracellular Ca2+, by nonselective cation channel blockers, Gd3+ (10 μM) or La3+ (100 μM), and by U73122 (1 μM), a PLC inhibitor with no effect of U73343 (1 μM), an inactive analogue of PLC. Under a voltage-clamp condition, BW723C86 (100 μM) also caused an inward current in a La3+-sensitive manner. Interestingly, OAG (100 μM), a membrane permeable DAG analogue, induced Ca2+ influx. RT-PCR analysis confirmed TRPC1 and TRPC6 expressed in MPG neurons. Taken together, these data suggest that Ca2+ influx occurs through TRP6 channels when activation of 5-HT2B receptors stimulates the Gq-PLC-DAG pathway.

In conclusion, various 5-HT receptors are functionally expressed in rat MPG neurons. Activation of 5-HT3 receptors increases [Ca2+]i and consequently enhances excitability primarily in parasympathectic neurons, which can be modulated via an AC/PKA-pathway. Activation of 5-HT2B receptors increased [Ca2+]i through TRPC6 channels independent of intracellar Ca2+ storage. Hence MPG neurons may provide a good model system for studies of communication between 5-HT3 receptors and other G-protein coupled receptors, and mechanisms of TRPC6 channel modulation by 5-HT receptors.