MUC8 protein structure and transcription regulation mechanism by the analysis of

Abstract

[한글]

우리의 이전 연구에서는 MUC8 유전자가 만성 부비동염의 비용 상피에서 과 발현되며, 배양 조건에서는 염증 매개체에 의해 발현이 유도되는 것을 보여주었다. 그러나, 지금까지 MUC8 단백의 기능은 잘 알려져 있지 못하다. 우리는 이미 알려진 MUC8 단백 서열이 극히 제한적이기 때문이라고 생각하여, MUC8 유전자를 포함하고 있는 염색체 12q24.3 locus의 염기 서열을 바탕으로, 이미 알려진 서열의 상위 서열에 대하여 RT-PCR과 5’-RACE-PCR을 수행하였다. Primer extension과 RPA를 통해 전사 개시 부위를 확인할 수 있었고, Kozak sequence를 통해 번역 개시 부위를 유추할 수 있었다. MUC8 cDNA는 전체 10292 bp로, 1733 bp의 5’-UTR, 8100 bp의 ORF, 그리고 459 bp의 3’-UTR로 이루어진 구조이다. 8100 bp의 ORF는 mucin 특이적인 tandem repeat 영역이 3군데 있으며, 그 영역을 구성하는 아미노산들은 glycosylation 가능성이 있는 아미노산 들이 주를 이루고 있다. Computer program에 기초하여 분석된 MUC8 domain은 막 결합형 mucin domain과 분비형 mucin domain을 모두 보여 주고 있다. 그러나, 실재로 우리의 이전 결과에 따르면, MUC8 단백이 ciliated cell에서는 발현되고, 분비형태를 나타내지 않아 막 결합 mucin임을 보여주었다. MUC8의 합성 후 위치 또는 기능을 분석하는 데 있어서 computer에 기초한 서열 분석은 한계가 있으며, 확인된 서열을 토대로 특이적인 MUC8 항체를 이용한 추가 실험이 필요할 것으로 본다.

앞서 확인된 MUC8 전사 개시 부위를 참조하여, 상위영역 -1644부터 +87 영역을 BAC clone에서 cloning할 수 있었다. 그리고, MUC8의 발현을 일으키는 신호 전달 경로와 관련된 전사 조절 인자 확인을 위해, 염증 유발 물질인 PGE2를 이용하였다. PGE2 신호는 ERK/RSK1/CREB을 통해 전달되며, MUC8 promoter 영역을 결손, 그리고 point mutation 결과로 -803의 CRE site가 MUC8 발현의 기본적인 activity를 유발함을 알 수 있었다. Cloning된 MUC8 promoter는 다양한 stimulator들이 MUC8 발현을 유도하는 과정을 이해하는 tool로써 사용될 수 있을 것으로 본다.

[영문]MUC8 gene expression is overexpressed in nasal polyp epithelium and is also increased by treatment with inflammatory mediators in nasal epithelial cells. These data suggest that MUC8 may be one of important mucin genes expressed in human airway. The MUC8 protein has been determined only to the extent of its short C-terminal sequence (313 amino acids), which can be inferred from 3’-end of its cDNA. This unique sequence appears to be composed of two types of consensus repeats, but this provides no clues into its function. Accordingly, we decided to clone a complete human MUC8 cDNA sequence. We have sequenced the full-length MUC8 cDNA from normal human nasal epithelial cells. MUC8 cDNA is 10292 bp long, and can be separated into 1733 bp of a 5’-untranslated region, 8097 bp of an open reading frame, and 459 bp of a 3’-untranslated region. MUC8’s open reading frame is derived from 9 exons. Deduced MUC8 peptide sequences reveal three unique tandem repeat regions, each composed of mucin-specific amino acids. The protein sequence of MUC8 contains both secreted- and membrane-bound domains. In addition, we cloned the - 1644 to + 87 region of genomic DNA upstream of the MUC8 transcription start site, and we examined the mechanism by which prostaglandin E2 (PGE2), an arachidonic acid metabolite, increases MUC8 gene expression levels. Here, we show that ERK MAP kinase is essential for PGE2-induced MUC8 gene expression in normal human nasal epithelial cells and that p90 ribosomal S6 protein kinase 1 (RSK1) mediates the PGE2-induced phosphorylation of cAMP-response element binding protein (CREB). Our results also indicate that cAMP-response element (CRE) at - 803 region of the MUC8 promoter is an important site of PGE2-induced MUC8 gene expression. In conclusion, these studies give insights into the molecular mechanism of PGE2-induced MUC8 gene expression and enhance our understanding on mucin hypersecretion during inflammation.