심정지 허혈 모델에서 신경조절물질에 의한 뇌손상 및 회복 변동

Abstract

[한글]

심폐소생술은 심정지에 대한 유일한 치료이며, 가장 즉각적인 치료가 필요하지만, 50년 동안의 많은 연구와 발전된 치료지침에도 불구하고 자발순환회복률이나 생존퇴원률이 뚜렷하게 향상되지 않았으며, 생존 후의 매우 불량한 신경학적 예후의 개선을 위한 치료방법의 제시에도 많은 논란이 있다. 따라서 현재로는 심폐소생술 과정에서 신경학적 치료를 위한 어떠한 치료도 지침에 제시되지 못하고 있다. 이에 임상적인 심정지 상황과 비슷한 연구환경에서 심정지에 의한 허혈성 손상이 일어난 후 심폐소생술 단계에서 신경보호작용이 있는 두 가지 약물을 병용 투여하면서 in-vitro연구와 in-vivo 연구를 시행하여 이러한 신경보호물질에 의한 뇌손상의 회복을 알아보고자 하였다.

In-vitro연구에서는 마우스 뇌세포를 배양하여 Oxygen glucose deprivation(OGD) 환경 후 재관류하였으며, 5-HT1A 수용체 효현제인 8-OH-DPAT과 caspase-3 의 반응 억제제인 z-DEVD.fmk를 투여한 후 세포 사망을 평가하기 위하여 lactate dehydrogenase(LDH) 유리값 측정을 하였고, Propidiuiodine(PI)염색을 하여 판독하였다. In-vivo 연구에서는 Sprague-Dawley종 수컷 랫드에서 심정지를 일으킨 후 심폐소생술 후 5-HT1A 수용체 효현제인 8-OH-DPAT를 피하주사하고 caspase-3 의 반응 억제제인 z-DEVD.fmk를 뇌실내 투여한 후 신경학적 검사를 위하여 Righting reflex Test, Placing reaction Test, Rota-rod Test를 하였으며, 랫드의 뇌를 적출하여 Cresyl violet 염색을 하여 관찰하였다.

실험결과의 통계분석은 State View (version 5.01, The SAS Institute, CA, USA) 프로그램을 사용하였고 일분산분석, Fisher PLSD test, Scheffe’s F Test를 이용하였다.

In vitro 연구 결과에서 OGD 90분 군을 24시간 재관류하여 5-HT1A agonist인 8-OH-DPAT과 casepase-3 inhibitor인 z-DEVD-fmk를 처치하였을 때 각각 투여와 병용투여군에서 control군과 OGD 90분 군의 24시간 재관류 군에 비하여 세포사망을 의의있게 억제하였으나 병용투여군과 각각 투여군 사이의 통계학적인 차이는 없었다. In-vivo 연구 결과에서 righting reflex와 placing reaction test에서는 각 실험군 간의 통계적 유의성은 없었다. Rota-rod test에서는 3회째의 결과에서 8-OH-DPAT와 z-DEVD.fmk 를 병용투여한 군에서 saline과 vehicle을 처치한 군에 비하여 통계적 유의성을 보였다. 랫드의 해마 CA1지역을 Cresyl violet 염색하였으며 병용 투여군에서 Saline+Vehicle 처치 군에 비하여 조밀한 세포분포를 보였다. 따라서 5-HT1A 수용체 효현제인 8-OH-DPAT과 caspase-3 의 반응 억제제인 z-DEVD.fmk를 랫드의 허혈성 손상 후에 병용 사용하여 in-vito연구에서는 신경보호효과가 없었으나 in-vivo연구에서는 뇌조직 및 기능향상에 효과가 있었다.

이러한 in-vitro연구와 in-vivo연구에서의 결과의 차이는 신경보호물질이 신경세포에 대한 직접적인 효과 뿐 아니라 가소성을 기초로 한 보상작용이 활발함을 알 수 있다. 즉 신경보호물질을 병용함으로써 효과를 기대할 수 있는데, 이 연구로서는 확실하지 않으나 약물 상호간의 화학적 관계 또는 신호전달과정의 중복 및 길항작용 등을 원인이라고 할 수 있다. 따라서 심정지라는 임상적인 허혈성 손상에서 신경보호물질을 후처치함으로써 허혈성 뇌손상을 줄일 수 있다고 사료된다.

[영문]Cardiopulmonary resuscitation(CPR) is the only treatment for cardiac arrest that requires most immediate treatment, despite of numerous studies and the improved treatment standards in the past 50 years, the return of spontaneous circulation(ROSC) or the rate of survival discharge has not been improved evidently, and the recommendations of treatment mode to improve the extremely poor neurological outcome after survival are controversial. Therefore, presently, the treatment standard for neurological therapy during the CPR procedure has not been established yet. Hence, to examine the recovery of the brain neuron injury by neuroprotective substances, in vitro study and in vivo study was performed by under the experimental environment similar to the clinical cardiac arrest condition, administering two drugs with neuroprotective activity during CPR after the occurrence of ischemic injury by cardiac arrest.

In in vitro study, mouse brain neurons were cultured, subjected to oxygen glucose deprivation(OGD),underwent reperfusion, added the 5-HT1A receptor agonist 8-OH-DPAT and the caspase-3 inhibitor z-DEVD.fmk, and to evaluate cell necrosis, the value of lactate dehydrogenase(LDH) release was measured and assessed by staining with propidium iodine(PI). In in vivo study, cardiac arrest was induced in Sprague-Dawley male rats, performed CPR, the 5-HT1A receptor agonist 8-OH-DPAT was injected subcutaneously and the caspase-3 inhibitor z-DEVD.fmk was injected intracerebroventricular, and as neurological tests, Righting reflex Test, Placing reaction Test, and Rota-rod Test were performed, and the rat brain was extracted, stained with Cresyl violet, and assessed. Thstatistical analysis of experiment results were performed using the StateView program (version 5.01, The SAS Institute, CA, USA), and one way ANOVA test, Fisher PLSD test, and Scheffe’s F Test were applied.

The result of in vitro study showed when the treatment of OGD 90 minutes group underwent reperfusion for 24 hours and treated with the 5-HT1A receptor agonist 8-OH-DPAT and the casepase-3 inhibitor z-DEVD-fmk, in the group treated with one agent and the group treated in combination, in comparison with control group and OGD 90 group underwent reperfusion for 24 hours, cell necrosis was suppressed significantly, however, thgroup treated with a single agent and the group treated in combination were not significantly different. The result of in vivo study showed that in the righting reflex test and placing reaction test, a statistically significant difference among experimental was not detected. The result of the 3rd Rota-rod test showed that in the group treated with the combination of 8-OH-DPAT and z-DEVD.fmk, in comparison with the group treated with saline and vehicle, a statistically significant difference was detected. In the staining of the hippocampus CA1 of rats with cresyl violet, cell distribution in the group treated with the combination was more dense than the group treated with saline + vehicle. Hence, in in vitro study that the 5-HT1A receptor agonist 8-OH-DPAT and caspase-3 inhibitor z-DEVD.fmk were added, neuroprotective effect was not detected, however, in in vivo study, it was effective on the improvement of brain neurons and neurologic function.

Such discrepancy between in vitro study and in vivo study shows not only the direct effect of neuroprotective substances on brain neuron but also the active compensation. In other words, the effect of the use of neuroprotective substances in combination can be expected, and although it is not clear in this experiment, it may be due to the mutual chemical relation of drugs or repetitive and antagonistic effect of neurotransmission. Therefore, it is conceivable that in clinical ischemic injury cardiac arrest, the posttreatment with neuroprotective agent may reduce ischemic brain injury.