The mechanism of differential sensitivity to DNA damage-induced apoptosis based on the degree of differentiation of colon cancer cell line

Abstract

[한글]

소화관 상피세포의 분화는 소화관의 항상성을 유지하기 위해 중요한 과정이나 아직 분화과정에 대한 이해와 분화에 따른 세포반응의 변화에 대한 기전은 알려지지 않은 것이 많다. 이 과정에서 세포 증식 및 사멸의 조절은 소화관 질환의 병인에 매우 중요하다. 본 연구에서는 세포분화에 따른 세포사멸 민감도의 변화와 세포사멸 자극에 의한 분화관련 분자의 변화, 그리고 세포사멸 민감도 변화의 관련 기전에 대해 알아보고자 하였다.

대장세포 분화모델로는 Caco-2 세포주의 세포밀집에 의한 자연분화 과정을 이용하였으며, 세포사멸 자극으로는 DNA 손상을 일으키는 MMS (methyl methanesulfonate)를 처리하였다. 분화와 관련된 분자 (NF-κB, p21, β-catenin, E-cadherin, PI3K/Akt pathway) 의 발현은 western blot, 면역형광염색법, 면역조직염색법을 통해 확인하였다. E-cadherin을 포함한 칼슘 의존적 세포접합의 억제를 위해 EGTA를 처리하였고, PI3K억제제로서 LY294002를 이용하였다. Akt 활성화와 세포사멸정도를 각각 p-Akt에 대한 western blot과 MTT 분석을 이용하여 측정하였다.

Caco-2세포는 분화됨에 따라 MMS에 의한 세포사멸이 유의하게 감소하였다. MMS에 대한 NF-κB와 p21의 발현을 비교하였으나, 세포분화 및 MMS 처리에 따라 의미 있는 변화는 없었다. 세포의 분화에 따라 E-cadherin과 p-Akt의 발현이 증가하였으며, 소장 조직에서도 선와에 비해 상부에서 발현이 증가됨을 확인 하였다. EGTA 전처치에 의해 칼슘 의존적 세포접합인자의 억제는 p-Akt 발현을 억제하였고, 칼슘 첨가에 의한 p-Akt 발현이 회복되었으며, 이는 분화된 세포에서 더욱 뚜렷하였다. EGTA 전처치 후 LY294002 처리는 칼슘 첨가에 의한 p-Akt 발현 회복을 억제하였다. 분화된 Caco-2세포는 미분화된 세포에 비해 MMS에 의한 세포사멸이 유의하게 감소하였으나, 이러한 차이는 EGTA 또는 LY294002 전처치에 의해 소멸되었다.

이상의 결과로 장관 세포의 분화에 따른 E-cadherin과 Akt의 활성화는 칼슘 의존적 세포접합 인자에 의한 PI3K/Akt 신호전달의 활성화와 관련이 있으며, 세포분화에 따른 MMS에 의한 세포사멸 민감도 감소의 분자적 기전으로 생각된다.

[영문]The balance between proliferation and apoptosis is important for homeostasis during differentiation in crypt-villus axis of intestinal epithelium. In addition, cellular responses to diverse stimuli also vary by the degree of cellular differentiation. However, their mechanisms remain largely unknown.

We investigated the differences in apoptotic sensitivities and its mechanism in genotoxin-induced apoptosis, based on the degree of differentiation of epithelial cells.

Differentiation was induced by post-confluence culture in Caco-2 cells. MMS (methyl methanesulfonate), which is a direct-acting DNA alkylating agent, was used for apoptosis induction. The apoptotic cell death was measured by MTT assay, and the expressional changes of differentiation- and cell survival-associated molecules (NF-κB, p21, β-catenin, E-cadherin, PI3K/Akt pathway) were evaluated by western blot, immunofluorescent study and immunohistochemical staining. EGTA and LY294002 were used for inhibition of cell-cell adhesion and PI3K, respectively.

Compared to the subconfluent Caco-2 cells, 7 days post-confluent cells showed resistance to MMS-induced apoptosis. In our differentiation model, NF-κB activation or cytoplasmic p21 expressions, which are known to be important in differentiation-induced resistance to apoptotic stimuli in other cell systems, were not observed. The expression of nuclear and cytoplasmic E-cadherin and β-catenin decreased in 7 days post-confluent Caco-2 cells, while their adherens junction components increased. E-cadherin and p-Akt expression increased in 7 days post-confluent Caco-2 cells, and in human intestinal tissue, the expression of E-cadherin and p-Akt also increased in the upper portion of villi, compared to crypt. Inhibition of cell-cell adhesion using EGTA decreased Akt phosphorylation, which was reversed by calcium restoration. Akt phosphorylation by calcium-mediated cell-cell adhesion was more prominent in differentiated cells. In addition, LY294002 treatment inhibited Akt phosphorylation by calcium-mediated cell-cell adhesion. The difference in MMS-induced apoptotic sensitivity between subconfluent and 7 days post-confluent Caco-2 cells was eliminated by inhibiting cell-cell adhesion or PI3K.

Our data demonstrate that apoptosis-resistant phenotype of differentiated epithelial cells in DNA damage-induced apoptosis is mediated by activation of cell adhesion-mediated PI3K/Akt pathway.