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긴털가루진드기(Tyrophagus putrescentiae)의 expressed sequence tags 분석 및 Tyr p 13의 알레르겐 항원성 규명

Other Titles
 Analysis of expressed sequence tags from tyrophagus putrescentiae and allergenic characteri 
Authors
 김우경 
Issue Date
2005
Description
의학과/박사
Abstract
[한글] 호흡기 알레르기에 있어 가장 중요한 흡입성 알레르겐으로 집먼지 진드기(Dermatophagoides 속)로 밝혀져 있으나, 최근 긴털가루진드기도 흡입성 알레르겐으로 관심을 끌고 있다. 본 연구는 긴털가루진드기의 알레르겐을 확인하고, 특성을 규명하고자 하였다. 또한 본 연구를 통해 알레르겐의 구조와 항원성(allergenicity)을 연구하는데 이용하고자 하였다. 긴털가루진드기의 전체 RNA 및 mRNA를 분리하여 cDNA library를 제작하였고 이를 이용하여 Expressed sequence tags(ESTs)를 분석하였다. 이중 fatty acid binding protein과 상동성이 있는 Tyr p 13의 재조합 항원을 발현 및 분리하였다. 긴털가루진드기의 조항원을 만들고 이것으로 대상 환자에게 피부시험을 시행하여 긴털가루진드기 항원에 양성를 보인 혈청으로 알레르기 항원성의 재검정을 위한 ELISA 시험과 ELISA 억제시험을 시행하였다. 총 대상 소아 환자 432명중 남녀비는 1.07:1의 비율이었으며 연령은 8±3세이었다. 이들 중에서 긴털가루진드기 피부시험에 양성인 소아 환자 54명의 남녀비는 26:28였으며 연령은 7±1세였다. 또한 긴털가루진드기에 양성인 성인 24명의 남녀비는 17:7였으며, 연령은 27±10세였다. 소아 환자 432명에서 12개 항원에 대한 피부시험의 양성률은 D. pteronyssinus(69.5%), D. farinae(57.8%), B. germanica(34.2%), P. americana(22.3%), cat(16.3%), Alternaria(15.7%), dog(12.8%), T. putrescentiae(12.7%), Penicillium(6.0%), oak(5.3%), ragweed(4.4%), alder(4.2%) 순으로 나타났다. 긴털가루진드기 피부시험에 양성인 소아와 성인 환자(n=78)의 피부시험 결과는 1+가 10례(12.8%), 2+가 24례(30.7%), 3+가 38례(48.7%), 4+가 6례(7.7%)였다. 피부시험 결과에서 긴털가루진드기에 양성을 보인 소아환자 54명의 총 IgE의 평균은 789.18±777.56 IU/mL, 호산구는 503.37±276.12/mm3 였으며, 성인환자 24명의 총 IgE의 평균은 860.73±1241.21 IU/mL, 호산구는 512.06±310.26/mm3 였다. 그러나 긴털가루진드기 양성 환자의 피부시험의 판독 결과와 총 IgE, 호산구 간에는 통계학적으로 의미 있는 연관 관계가 없었다. 긴털가루진드기의 전체 446 클론 중에 22개 클론이 fatty acid bindig protein과 상동성을 이루었으며, 이 중 8개 클론이 진드기 group 13 allergen과 유사하였다. 전체 nucleotide sequence의 길이는 643으로(Genbank accession number AY710432) open reading frame은 132개의 아미노산 단백으로 구성되었다. 단백질의 pI값은 7.22였으며 분자량은 14.57 kDa이었다. 아미노산 배열은 Aca s 13(A. siro)에 85.3%, Lep d 13(B. torpicalis)에 62.3%, Lep d 13(L. destructor)에 61.1% 의 상동성이 관찰되었다. 재조합 Tyr p 13(recombinant Tyr p 13, rTyr p 13)은 분리에 용이 하도록 짧은 N-terminal fusion protein과 함께 E. coli에 발현시켰다. 재조합단백질의 분자량은 18.71 kDa이다. Bradford assay에 의해서 측정한 rTyr p 13의 발현량은 5.43 mg/mL이었다. 재조합 알레르겐인 rTyr p 13은 T. putrescentiae 피부시험에 양성인 78명의 환자혈청 중에서 5명이 양성반응을 보였다(6.4%). T. putrescentiae 조항원은 10 μg/mL 억제 농도에서 93.6%의 최대 억제를 보였으며, rTyr p 13은 10 μg/mL 억제 농도에서 40.9%의 최대 억제를 보였다. 이상의 결과로 그 동안 알려진 mite group 2 알레르겐 외에 긴털가루진드기에서 Tyr p 13을 새로이 규명하였으며 그 결과 주알레르겐 연구에 도움을 줄 것으로 사료된다. 또한 rTyr p 13이 다른 진드기와 교차 항원성을 더 규명하여, 향후 긴털가루진드기 유전자 클로닝을 통한 rTyr p 13의 생산으로 진단용 시약 및 치료용 약제를 개발하는데 기초 자료를 제공할 수 있을 것으로 판단된다.
[영문]Storage mite is one of the important causes of allergic disorders. Fifteen allergenic components were demonstrated by SDS-PAGE and immunoblotting. so far only group 2 allergen, Tyr p 2, has been cloned and characterized from Tyrophagus putrescentiae. In this study, we tried to identify and characterize new allergens from T. putrescentiae, which is a dominant species of storage mites in Korea. Expressed sequence tags (ESTs) were analyzed to investigate the allergens of the storage mites. A clone with cDNA sequence encoding a protein homologous to fatty acid binding protein, mite group 13 allergen, was identified, which was named Tyr p 13. The deduced amino acid sequence shows 61.1-85.3% identity with other mite group 13 allergens. The recombinant protein was expressed in Escherichia coli using pET 28b vector system and its allergenicity was investigated by ELISA. The recombinant allergen was reacted with 5/78 (6.41%) by T. putrescentiae-positive sera. It inhibited 40.9% of IgE binding to crude extract at an inhibitor concentration of 10 g/mL by inhibition ELISA using serum from a patient who showed the strongest reaction by ELISA In this study, Tyr p 13 was found to be minor allergens, however, it may be different in farmers, who were reported to have a high prevalence of storage mite sensitization. A novel allergen from T. putrescentiae has been identified and it may be used help more precise diagnosis. It could be helpful for more detailed characterization of storage mite allergy.
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1. College of Medicine (의과대학) > Others (기타) > 3. Dissertation
URI
https://ir.ymlib.yonsei.ac.kr/handle/22282913/122266
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