The classification of spinal neurons and the changes of synaptic neurotransmission in the micturition reflex pathway after intravesical electrical stimulation

Abstract

[한글]

방광내 전기자극치료는 A델타 섬유에 있는 기계적 수용체를 활성화함으로써 배뇨 중추에서 흥분성 연접부 신경전달 증대를 통해 궁극적으로 중추 배뇨반사의 조정을 이룬다고 알려져 있다. 본 연구는 방광내 전기자극 치료의 기전을 규명하기 위하여, 척수손상군과 척수손상 후 전기자극군에서 배뇨반사에 관련된 척수 신경세포를 분류하였고, 연접부 신경전달의 변화를 살펴보았다.

Sprague-Dawley 암컷흰쥐를 사용하여 겉보기 수술군 (n=5), 빙초산 2시간 처리군 (n=5), 척수손상 6주군 (n=10), 척수손상 6주 후 방광내 전기 자극군 (n=10)의 실험군으로 나누고, L6-S1 척수에서 c-Fos, pseudorabies 바이러스, 그리고 콜린아세틸트랜스퍼레이즈에 대한 이중 형광염색을 시행하여 배뇨반사에 관여하는 신경원을 분류하였다. 또한, 흥분성 및 억제성 신경전달물질 (GABA), 신경전달물질 수용체 (NMDAR1), 수송체 (GLT, GLAST, EAAC, GAT1, GAD65)의 변화를 살펴보았다.

배뇨반사에 관련된 중간신경원과 신경절전신경원은 pseudorabies 바이러스와 c-Fos에 이중 염색된 신경세포로 pseudorabies 바이러스 양성세포 중 40%가 c-Fos에 이중염색 되었고 대부분 척수의 엉치부교감신경핵과 등쪽교차 지역에서 발현된다. 또한, 콜린아세틸트랜스퍼레이즈와 c-Fos에 이중염색된 신경세포들은 배뇨반사에 관련된 신경절전신경원으로 콜린아세틸트랜스퍼레이즈 양성세포 중 90%가 c-Fos와 이중염색 되었다. 각 군에서 세분화된 신경세포의 분포의 변화는 없었으나, 척수손상군에서 증가를 보인 c-Fos가 전기자극 후 감소함을 확인하였다. c-Fos 발현의 변화와 관련하여 연접부 신경전달을 조사해보면, 척수손상군에서는 정상대조군에 비해 NMDAR1의 증가가 뚜렷하고 척수손상 후 전기자극군에서 감소하였다. 반면, GABA는 척수손상군에서 발현 정도가 감소하고, 척수손상 후 전기자극을 주면 정상대조군의 수준으로 회복된다. 또한, GLT1, GLAST 와 EAAC1는 모두 척수손상 군에서 척수뒤뿔의 얕은층을 포함한 척수 전체 회색질에서 강한 양성을 나타내며 척수손상 후 전기자극을 주면 모두 정상대조군 수준으로 감소한다. GAT1의 경우, 글루타메이트 수송체의 분포와는 달리 정상대조군에서 척수뒤뿔의 얕은층과 중심관 주위, 엉치부교감신경핵과 척수앞뿔을 따라 강한 양성반응을 나타내며, 척수손상군과 척수손상 후 전기자극 군에서는 감소한다. GAD65는 각 군에서 유의한 차이를 보이지 않았다.

척수손상군에서 NMDAR1의 발현 증가와 GABA의 감소는 세포생존에 치명적인 것으로 항상성을 유지시키기 위해서, GLT1, GLAST, EAAC1과 같은 글루타메이트 수송체 단백질의 활성이 진행된다. 척수손상군에 전기자극을 주면 NMDAR1, GABA, 그리고 수송체 발현 정도는 정상대조군과 비슷한 양상을 나타내는 것으로 보아 흥분성과 억제성 신경전달의 균형이 회복됨을 확인할 수 있었다. 또한, 전기자극의 효과가 억제성 신경전달의 균형에 관여하는 기전은 GABA의 분비증가와 GABA 재흡수 억제로 인한 억제성 신경전달 활성화로 생각된다.

[영문]Intravesical electrical stimulation (IVES) is used clinically to improve bladder evacuation in patients with inadequate micturition contractions. The aims of the present experimental study were 1) to identify the changes in the afferent reflex pathway from the bladder to the interneurons in the L6-S1 spinal cord, using classifications of the spinal neurons in sham with acetic acid infusion, spinal cord injury (SCI), and SCI with IVES 2) to observe changes in synaptic transmission concerning the immunohistochemistry of neurotransmitter receptors, neurotransmitters and neurotransporters.

A substantial percentage (40%) of pseudorabies virus (PRV) labeled neurons, and a larger percentage (90%) of ChAT-IR cells exhibited c-Fos-IR in each group. The distribution and number of double-stained neurons in each group were not statistically significant (p>0.05). However, in the SCI with IVES group the number of c-Fos-IR neurons was significantly lower than that of the rats who had undergone spinalization alone. With regard to transporters related to changes in c-Fos expression, NMDA receptor 1 (NMDAR1), GLT1, GLAST, and EAAC1 in the SCI group exhibited overall increases, as compared to the control group, and significant decreases in the SCI with IVES group (p<0.001). Gamma-aminobutyric acid (GABA) protein following SCI was significantly less than that in the control group in L6-S1 spinal cord, and was higher in the SCI with IVES group than in the SCI group (p<0.001). GABA transporter 1 (GAT1) was lower in both SCI and SCI with IVES groups than in the normal group (p<0.05). Glutamic acid decarboxylase 65 (GAD65) showed no differences among groups.

Based on this anatomical evidence, we confirmed that no changes occurred in distribution in the subdivided spinal neurons associated with micturition reflex pathway in each group. In particular, the distribution of double stained neurons in the spinalized rats was quite similar to that seen with the sham with acetic acid rats. This indicated that c-Fos expression was mediated by synaptic afferent input or input from segmental interneurons, rather than being due to the activation of supraspinal micturition reflex pathways, as was reported previously. In addition, increases in the c-Fos-IR neurons of spinalized rats, and decreases in the c-Fos-IR of the IVES group with spinalized rats may be mediated by neurotransmitters which are related to primary afferent terminals as well as to interneurons which help from the spinal polysynaptic pathway. The expression of c-Fos protein in SCI may be affected by inhibitory neurotransmitters and excitatory neurotransmitter receptors. Enhanced excitatory neurotransmssion, and the decrease of synaptic inhibition in the SCI group were altered by IVES, and both glial and neural transporters were determined to be important in the regulation of neurotransmitter homeostasis after SCI. IVES may contribute to the regulation of balance between excitatory and inhibitory neurotransmission, via alteration in neurotransmitters, receptors and transporters.