p53 변이체를 발현하는 종양 선택적 살상 아데노바이러스의 암세포 살상능 분석

Abstract

[한글]

p53 변이체를 발현하는 종양 선택적 살상 아데노바이러스의 암세포 살상능 분석// p53 유전자는 17번째 염색체에 위치하고 있는 종양 억제 유전자로써, 폐암, 난소암, 유방암, 직장암, 두경부암 등 인체 종양의 50% 정도에서 유전자 변이가 나타난다. p53 단백질의 전사활성은 암세포에서 세포고사를 유도하는데 결정적인 역할을 하며, 생체 내에서 p53의 활성도는 mdm2에 의해 음성 피드백(negative feedback) 조절을 받는다. p53 유전자가 정상형으로 밝혀진 종양에서도 mdm2의 과다발현 또는 human papilloma 바이러스에 의한 감염 등으로 p53이 비활성화 되어 있는 경우가 빈번한 것으로 보고되었다. 최근의 연구 결과들에 의하면, DNA 결합 능력이 손상된 p53을 발현하는 암세포에 야생형의 p53 유전자를 형질 도입하면 암세포 증식이 중지되고, 세포고사가 유도되는 현상이 밝혀졌다. 하지만 mdm2의 발현이 높은 암의 경우에는 야생형의 p53을 도입하더라도 암세포 내에 고농도로 존재하고 있는 mdm2에 의해 p53의 분해가 유도되므로 p53에 의한 암세포 살상 효과를 크게 기대하기가 어렵다. 이러한 연구들을 바탕으로, 본 연구에서는 p53의 음성 조절 부위인 N-말단 또는 C-말단을 제거하여 p53의 지속적인 발현을 유도할 수 있는 새로운 구조의 p53 변이체들을 제작하고, 이들을 암세포 특이적 살상 아데노바이러스에 탑재하여 항종양 효과를 유도하고자 하였다. p53의 부조절 기능을 수행하는 C-말단 부위를 제거한 p53△30, p53의 N-말단 부위를 Herpes simplex virus의 VP16 전사활성 부위로 치환한 p53-VP, 그리고 p53의 N-말단 부위를 VP16 전사활성 부위로 치환하고 동시에 C-말단 부위를 제거한 p53△30-VP 변이체들을 각각 제작한 뒤 이들의 활성도를 검증한 결과, p53△30, p53△30-VP, p53-VP의 순서대로 활성도가 증가하였으며, 특히 p53△30와 p53△30-VP의 활성은 야생형 p53에 비해 약 3～4배로 크게 증가하였다. 또한, 이들 변이체들을 복제 불능 아데노바이러스와 암세포 특이적 살상 아데노바이러스에 도입한 결과, 세포 살상능이 현저하게 증가하였다. 특히, 복제 불능 아데노바이러스에 도입한 경우에는 dl/p53△30 바이러스의 세포 살상능이 가장 높은 반면, 암세포 특이적 살상 아데노바이러스에 도입한 경우에는 Ad/m△19-p53△30-VP 아데노바이러스의 세포 살상능이 가장 높게 나타났다. 또한, p53 단백질의 발현 양상을 비교한 결과에서도, 세포 살상능이 가장 높은 dl/p53△30와 Ad/m△19-p53△30-VP 아데노바이러스에 의한 p53 발현량이 가장 높음을 확인할 수 있었다. 이와 더불어 세포고사 빈도를 확인할 수 있는 TUNEL 분석과 FACS 분석을 시행한 결과에서도, Ad/m△19-p53△30-VP에 의해 유도되는 세포고사 빈도가 가장 높게 유도됨을 확인하였다. p53의 활성화는 항암제 또는 방사능을 이용한 효과적인 암치료에 필수적으로, 활성이 증대된 p53 변이체는 항암제 또는 방사능과 함께 병용 투여될 경우에 항암 효과를 현저히 증대시킬 수 있을 것이다. 또한, 활성이 증대된 p53 변이체를 아데노바이러스에 탑재하여 암 유전자 치료에 이용한다면 mdm2가 과발현된 암세포 뿐 아니라 암세포 내에 불활성화 되어 있는 p53의 활성도를 개선시킴으로서 보다 효과적으로 암세포의 세포고사 및 세포성장 억제를 유도할 수 있을 것으로 생각된다.

[영문]Effect of recombinant adenoviruses expressing p53 variants on tumor cell killing/ / Taeyoung Koo// Department of Medical Science/ The Graduated School, Yonsei University/ / (Directed by professor Chae-Ok Yun)// The tumor suppressor gene, p53, located on chromosome 17q, is mutated or lacking in at least 50% of human cancers, including lung cancer, cervical cancer, breast cancer and head and neck cancer. The p53 gene encodes a transcription factor that plays a critical role in apoptosis in cancer. Mdm2, a major negative regulator of p53, inactivates p53 protein by binding its transcriptional activation domain. Mdm2 overexpression or infection of human papilloma virus is common in cancer, and most of these tumors retain wtp53, suggesting that tumors with mdm2 overexpression bypass the need to mutate p53. In recent research, transient expression of the p53 gene via adenovirus-mediated gene transfer induces apoptosis in cells expressing mutant p53, while causing cell cycle arrest in cells with wtp53. However, since many cancer cells overexpress mdm2, and high levels of mdm2 inactivate and cause degradation of p53, the transfer of wtp53 into cells that overexpress mdm2 is unlikely to be efficacious. To overcome the inhibition of p53 by mdm2 and increase transcriptional activity of p53, 3 different kinds of p53 variants genes were constructed, generating p53△30 (deletion of C-terminal region of p53), p53-VP (substitution of N-terminal region of p53 with activation domain of VP16), and p53△30-VP (deletion of C-terminal region and substitution of N-terminal region of p53 with activation domain of VP16). As assessed using relative luciferase activity, the functional transcriptional activity of all three kinds of p53 variants was greatly enhanced in comparison to wtp53. In particular, the activity of p53△30 and p53△30-VP showed over 3- to 4-fold enhanced transcriptional activity. In addition, we have introduced wtp53 and the p53 variants at E1 and E3 region of replication-incompetent adenovirus, dl/Z, or oncolytic adenovirus, Ad/m△19, respectively. Ad/m△19-p53△30-VP expressing p53△30-VP significantly enhanced cytopathic effect and cell-killing activity in all tumor cell lines tested. Moreover, TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling) assay and Annexin-V/PI double staining indicate that apoptotic ratio induced by Ad/m△19-p53△30-VP was superior to those of other adenoviruses expressing wtp53 or p53△30. Taken together, these lines of evidence demonstrate that the newly generated adenoviruses expressing p53 variants elicit enhanced cancer cell killing, and suggest their utility and potential in improving the efficacy of adenovirus-mediated cancer gene therapy.