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대장암 세포에서 lactobacilli와 lactobacilli 배양 배지가 IL-1β 자극에 의한 IL-8 생성에 미치는 영향

Other Titles
 Effect of lactobacilli and lactobacilli-conditioned media on IL-1β induced IL-8 production in Caco 
Authors
 최창환 
Issue Date
2004
Description
의학과/박사
Abstract
[한글]



Probiotics는 건강에 이로운 효과를 나타내는 살아있는 organism으로서 lactobacilli, bifidobacteria, streptococci 등의 세균과 yeast 인 Sacharomyces boulardii 등이 널리 알려져 있다. 최근에 probiotics가 아토피, 급성 설사, 염증성장질환 등 여러 염증성 질환의 치료와 예방에 효과가 있다는 보고가 많은데 아직 염증억제 기전에 대한 연구는 매우 부족하며, 실제 염증을 억제하는 물질에 대해서도 거의 알려진 바가 없는 실정이다. 이에 연구자는 대장암 세포(Caco-2 세포)에서 probiotics인 lactobacilli가 IL-1β 자극에 의한 IL-8의 생성과 그 중간 신호전달경로인 NF-κB에 미치는 영향을 알아보고, 실제 염증을 억제하는 물질을 밝혀 보고자 하였다.

Lactobacilli로는 L. casei rhamnosus GG (LGG), L. casei YIT 9018, L. acidophilus HY2177, L. casei HY2743 등 4가지 균주를 사용하였다. IL-8의 생성량은 ELISA 방법으로 측정하였고, IL-8 유전자의 전사활성도와 NF-κB 활성도는 luciferase reporter assay로 측정하였으며, IκB-α 분해 정도는 western blot을 이용하여 분석하였다. Lactobacilli의 생존여부가 IL-1β에 대한 반응에 영향을 미치는지 알아보기 위하여 항생제, formaldehyde 또는 열처리한 LGG를 사용하였으며, lactobacilli의 어떤 구성성분이 IL-1β에 대한 반응에 영향을 미치는지 밝히기 위하여 LGG를 sonication하여 얻은 extract와 debris를 사용하였다. 또한 lactobacilli가 분비하는 물질이 IL-1β에 대한 반응을 억제하는지 알아보기 위하여 LGG 배양 배지(LGG-cm)를 사용하였으며 LGG-cm에 포함된 IL-1β에 대한 반응 억제물질의 성질을 규명하기 위하여 DNase I, proteinase K 또는 열처리한 LGG-cm을 사용하였다.



1. Caco-2 세포에 IL-1β를 처리하였을 때 IL-8 생성이 유의하게 증가하였고, IL-1β 처리 30분전에 LGG, L. casei YIT 9018, L. acidophilus HY 2177, 그리고 L. casei HY 2743을 각각 전처치 하였을 때는 lactobacilli 농도에 비례하여 IL-8생성이 유의하게 억제되었다.

2. IL-8 유전자의 전사활성도와 NF-κB의 활성도는 IL-1β 처리 후 각각 4.6배 및 4.3배 증가하였으며, 이러한 활성도의 중가는 전처치한 LGG농도에 비례하여 억제되었다. IL-1β에 의한 IκB-α 분해 정도는 대조군 세포의 IκB-α 레벨을 100%로 하였을 때 IL-1β를 처리하고 15분 경과 후에는 81%가 분해되어 19%만 남아 있었고, 30분, 60분, 그리고 90분 경과 후에는 각각 29%, 49%, 56%로 회복되었다. LGG를 전처치한 후 IL-1β를 처리하였을 때는 15분, 30분, 60분 경과 후 IκB-α 레벨이 각각 56%, 59%, 93%로 회복되어 I-κBα 분해가 완전히 억제되지는 않았으나 부분적으로 억제되었다.

3. LGG의 IL-1β에 의한 IL-8 생성 억제 효과는 LGG를 항생제 혹은 formaldehyde로 처리하여도 유지되었으나 열처리하면 소실되었다.

4. LGG를 sonication 시킨 후 분리한 debris는 IL-1β에 의한 IL-8 생성 억제 효과를 보였으나 extract는 억제효과를 가지지 않았다. LGG debris의 IL-1β에 의한 IL-8생성 억제 효과는 LGG debris를 formaldehyde로 고정하여도 유지되었으나 열처리하면 소실되었다.

5. 실험에 이용한 4가지 lactobacilli의 배양배지(lactobacilli-cm)는 모두 IL-1β에 의한 IL-8 생성을 억제하였으며, LGG-cm을 proteinase K, DNase I 또는 열처리하여도 IL-1β에 의한 IL-8 생성 억제 효과는 유지되었다.



결론적으로 본 연구를 통하여 사람 장 상피상피(Caco-2 세포)에서 LGG가 IL-1β 자극에 의한 IL-8 생성을 억제하는 것을 확인하였으며, 이러한 효과는 최소한 부분적으로는 NF-κB 경로의 억제를 통해 이루어진다는 것을 알 수 있었다. IL-8 생성을 억제하는 효과는 LGG의 구조를 이루는 물질과 LGG가 분비하는 물질 모두가 가지고 있으며 이 두 가지 물질의 성질이 서로 다르다는 것을 확인하였다.



[영문]

Probiotics are live non-pathogenic organisms that belong to the resident microflora, and confer health benefits by multiple mechanisms. Lactobacillus sp. is one of the probiotic bacteria that ameliorates intestinal injury and inflammation caused by various stimuli. We aimed to evaluate the effect of lactobacilli and media conditioned by lactobacilli (lactobacilli-cm) on IL-1β-induced IL-8 production in Caco-2 cells, and to find out what components of lactobacilli have this effect.

Methods: Caco-2 cells were stimulated with IL-1β in the presence or absence of L. casei rhamnosus GG (LGG), L. casei YIT 9018, L. acidophilus HY2177, L. casei HY2743, or lactobacilli-cm. Production of the pro-inflammatory chemokine IL-8 was measured in supernatants by ELISA. Transcriptional activity of IL-8 gene and NF-κB-responsive gene were evaluated by transient transfection of luciferase reporter gene. The effect on IκB-αdegradation was evaluated by western blot. To determine the nature of immunomodulatory molecules, LGG was modified to the following: antibiotics (penicillin and streptomycin) treatment, 4% formaldehyde treatment at 4℃, 15 min heating at 95℃, or sonication. Conditioned media was subjected to the following: 15 min heating at 95℃, 30 min DNase I treatment at room temperature, or 60 min digestion at 37℃ with proteinase K followed by a 10 min heat inactivation at 95oC.

Result: We demonstrated that the pretreatment of LGG, L. casei YIT 9018, L. acidophilus HY2177, and L. casei HY2743 inhibited IL-1β-induced IL-8 production in Caco-2 cells (by 97%. 55%, 95%, and 95%, respectively; p<0.01 for each). LGG, dose dependently, attenuated the IL-1β-induced transcriptional activation of IL-8 gene and NF-κB responsive gene. LGG also attenuated IL-1β-induced I-κBα degradation. Formaldehyde-fixed or antibiotics-treated LGG maintained the inhibitory effect, but heated LGG lost this effect. Sonicated LGG debris had similar inhibitory effect with whole LGG. LGG-conditioned media attenuated the IL-1β-induced IL-8 production and this effect was maintained after heating, and proteinase K or DNase I treatment.

Conclusion: Lactobacilli inhibited the IL-1β-induced IL-8 production in Caco-2. This attenuation was at the transcriptional level, at least in part, via inhibition of the NF-κB signaling pathway. Both structural material of lactobacilli and soluble factor secreted from lactobacilli inhibited the IL-1β-induced IL-8 production, and they might be different substances.
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1. College of Medicine (의과대학) > Dept. of Internal Medicine (내과학교실) > 3. Dissertation
Yonsei Authors
Choi, Chang Hwan(최창환)
URI
https://ir.ymlib.yonsei.ac.kr/handle/22282913/122178
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