저등급 표재성 방광암의 재발에서 MMP의 분석과 전사체 발현

Abstract

[한글]

방광암은 전 세계적으로 남성암 중 4위, 여성암 중 8위를 차지하고, 국내에서는 남성암 중 5위를 차지할 정도로 흔한 종양이다. 방광암은 진단시 80%가 표재성 암으로 경요도절제술 및 방광내 항암요법 등의 보존적 요법으로 치유가능하며, 5년 생존율도 약 90%로서 예후가 비교적 양호하다. 그러나 표재성 방광암은 경요도절제술 및 방광내 항암요법 등의 보존적 요법에도 불구하고 장기 추적관찰시에 50-90%는 재발하고, 재발 시 20-30%는 침윤성이나 분화도가 더 나쁜 암으로 악성 진행된다. 임상적으로 표재성 방광암의 재발위험도가 높은 경우는 종양이 3개 이상의 다발성이거나, 3cm 이상으로 큰 경우, 분화도가 나쁜 경우, 상피내암이 존재하는 경우를 들고 있다. 실험적으로 방광암의 재발 및 악성진행의 위험도를 예측할 수 있는 방법으로는 암종의 유세포측정 (flow cytometry)과, Ki67, PCNA, ras gene 계열, p21, H-ras, K-ras, c-myc, c-ERF-2, EGF, EGF-R, p53, Rb 등의 인자에 대한 발현 관찰 등이 있다. 그러나 이러한 인자들은 대부분 저등급 분화도의 표재성 방광암에 비해 고등급 분화도나 침윤성에서 의의있게 발현되며, 표재성 방광암에서 이들 인자들이 발현되는 경우 재발 및 악성진행에 관여하고 예후가 나쁜 것으로 보고되고 있다. 한편 저등급 분화도의 표재성 방광암의 경우 악성진행이나 전이되는 경우는 적으나 50%정도에서는 지속적 재발이 이루어지고 있다. 그러나 이러한 저등급 분화도 표재성 방광암의 재발 기전에 관한 연구는 미비하다.

이에 본 연구에서는 저등급 분화도의 표재성 방광암에서 재발에 관여하는 분자생물학적 인자를 밝히고자 하였다.

본 연구는 저등급 표재성 방광암의 재발군과 미-재발군의 환자 15명씩을 대상으로 하였다. 저등급 표재성 방광암으로 경요도절제술을 시행 후 6개월 이상의 추적 방광경검사에서 종물이 보이며, 경요도절제술로 다시 병리조직학적으로 방광암이 진단된 경우를 재발군으로 분류하였고, 1년 이상 추적 방광경검사나 요세포검사에서 암의 증거가 없는 경우를 미-재발군으로 분류하였다.

저등급 표재성 방광암의 재발에 관여하는 전사체 발현을 규명하기 위하여 재발군과 미-재발군의 조직에서 MMP 및 종양유전자와 세포주기 조절유전자를 포함하는 0.12K cDNA array를 시행하여 의미있는 인자를 선택하였다. 재발군에서 의의있게 발현된 인자에 대해 mRNA 발현변화를 측정하고자 실시간 역전사 중합효소연쇄반응 (real-time quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction; real-time RT PCR)을 시행하였으며, 단백 발현의 변화를 관찰하고자 Western blot을 시행하였다.

저등급 표재성 방광암 조직에서 0.12K cDNA array 결과를 분석한 결과 MMP-1, 2, 9, 12, 15, TGFβ1, VEGF와 fos 유전자가 미-재발군에 비해 재발군에서 의의있게 발현이 증가되었다.

이들 인자들에 대해 재발군과 미-재발군의 조직에서 real-time RT PCR를 시행하여 mRNA 발현변화를 관찰한 결과 MMP-1, 12, TGFβ1, VEGF와 fos가 미-재발군에 비하여 재발군에서 의의있게 발현이 증가되었다. MMP-2, 9, 15는 재발군에서 발현이 증가되어 있는 경향을 보이나 통계적으로 의미는 없었다.

재발군과 미-재발군의 조직에서 Western blot을 시행하여 단백 발현을 관찰한 결과 MMP-1, 12, TGFβ1, VEGF와 fos가 미-재발군에 비해 재발군에서 의의있게 증가되었다

연구 결과 저등급 표재성 방광암에서 미-재발군에 비하여 재발군에서 MMP-1, 12, TGFβ1, VEGF 및 fos의 발현이 의의있게 증가하였으며, 저등급 표재성 방광암의 재발에는 MMP-1, 12, TGFβ1, VEGF 및 fos가 연관이 있는 것으로 여겨진다.

[영문]Bladder cancer is 5th most common cancer in korean men. Superficial bladder cancer is curable with transurethral resection of tumor and BCG instillation. But majority of these patients develop tumor recurrences following endoscopic resection. Clinical risk factors of recurrences are high grade, multiplicity, large size and association with carcinoma in situ. Molecular prognositic markers are p53 expression, retinoblastoma gene, Ki 67 and proliferating cell nuclear antigen. But, these molecular prognostic markers are commonly associated with high grade and tumor progression. However 50% of superficial low grade urothelial bladder cancer is recurred without progression. Thus, the current clinicopathologic study for evaluation of superficial low grade urothelial bladder cancer still has limitations in predicting the true behavior of recurrence. We aimed to clarify the prime role of recurrence in superficial low grade urothelial bladder cancer.

Thirty cases of low grade superficial bladder cancer diagnosed with transurethral resection were analyzed. Fifteen cases were recurred case and 15 cases were non-recurred case. Recurrence was defined as visible mass during cystoscopy at least 6 months later after transurethral resection, and no-recurrence defined as there was no evidence of tumor with cystoscopy and urine cytology for more than 1 year of follow up period. We studied with fresh frozen tumor tissue.

To determine expression profiles, real-time RT PCR were performed subsequently to evaluate the validity of meaningful molecules identified by 0.12K cDNA array experiment surveys mainly composed of MMP, oncogenes and cell-cycle-related genes. Recurred fifteen superficial low grade urothelial bladder cancer patients were compared with those who have not been recurred for more than 1 year of follow up period.

On cDNA microarray data analysis of recurred and non-recurred patients, the genes of MMP-1, 2, 9, 12, 15, TGFβ1, VEGF and fos were found to be significantly upregulated in the recurred cases. On transcriptional assay by real-time RT PCR analysis to validate those molecules, the transcripts of MMP-1, 12, TGFβ1, VEGF and fos were significantly overexpressed in recurred group than in the non-recurred group. The expression of MMP-2, 9, and 15 were overexpressed, but not statistical significant. With Western blot, MMP-1, 12, TGFβ1, VEGF and fos showed significant overexpression in the recurred group than in the non recurred group.

In conclusion, the overexpression of MMP-1, 12, TGFβ1, VEGF and fos could be strongly associated with the recurrence in superficial low grade urothelial cancer.