새로운 혈관생성억제제인 KJ3가 동소이식 유방암 백서에서 신생혈관생성에 미치는 영향과 기전

Abstract

[한글]

새로운 혈관이 생기는 신생혈관생성은 종양의 성장과

전이에 중요한 기전으로, 이의 차단은 종양치료에 하나의 새로운 전략이 될 수 있다. 본 연구에서는 Embellisia chlamydospora KF208에서 추출한 KJ3의 신생혈관생성 억제작용을 생체외 및 생체내 검사를 통하여 검증하였고, 작용 기전을 알아보기 위하여 실험동물의 유방암에서 matrix-metalloproteinase(MMP)-2와 MMP-9, vascular endothelial growth factor(VEGF)의 발현을 측정하였다. 세포독성을 보이지 않는 KJ3의 최적농도를 구하기 위한 혈관내피세포 생존 분석은 trypan blue exclusion 방법을 이용하였다. 생체외 혈관 내피세포의 신생혈관생성 억제작용을 검사하기 위하여 혈관내피세포 침습 및 생체외 모세관 형성 검사를 시행하였다. 생체내에서의 영향은 chick embryo의 융모요막을 이용하여 검사하였다. 백서에서 KJ3의 신생혈관생성 억제작용을 검사하기 위하여 C3H/HeJ 백서에서 FM3A 유방암을 이용하였다. 7주령의 암컷 C3H/HeJ 백서를 네 군(n=24)으로 나누어 FM3A 종양조직을 피하조직에 주입한 후, 생리식염수와 KJ3, fumagillin과 betulinic acid를 미리 FACS를 이용하여 구한 FM3A의 LD50의 1/3 씩을 복강내로 0, 2, 4, 6 일째에 주입하고, 종괴의 크기와 백서의 무게를 측정하였다. 실험 7일째 백서를 희생하여 종괴를 얻은 후, zymography를 이용하여 MMP-2와 MMP-9의 활성을, ELISA를 이용하여 VEGF의 발현을 알아보았다. 혈관내피세포 생존 분석에서 KJ3 농도가 20 ㎍/㎖ 이하에서는 생존세포의 수가 95% 이상이었다. 생체외 혈관내피세포 침습 검사 결과 bFGF 30 ng/㎖에 의하여 유도되는 세포침습은 KJ3의 용량에 비례하여 억제되었다. 생체외 모세관 형성 검사에서도 bFGF 30 ng/㎖ 투여에 의하여 유도되는 모세관 형성이 KJ3 10 ㎍/㎖ 투여에 의하여 억제되었다. 융모요막 검사에서 대조군은 10%의 억제율을 보인 반면 계란 1개당 KJ3 10, 100, 200 ㎍이 투여된 군들에서는 각각 47, 64, 86%의 억제율을 보였다. C3H/HeJ 백서에 주입한 FM3A 종괴에서는 양성대조군으로 사용한 fumagillin과 betulinic acid 투여군에서와 같이 KJ3 투여군에서도 종괴 증식억제를 보였는데, 음성대조군과 비교시 종괴주입 후 2, 4, 6일 모두 통계적으로 의의있는 감소를 보였다 (p<0.05). MMP-2는 각 군 모두 발현이 없었으나, MMP-9는 대조군보다 KJ3, fumagillin, betulinic acid 투여군에서 의의있게 증가하였다 (p<0.05). ELISA를 이용한 mouse VEGF 측정결과 KJ3와 betulinic acid 투여군은 대조군에 비하여 의의있게 감소한 VEGF의 발현을 보였으나(p<0.05), fumagillin 은 대조군과 비슷한 발현을 보였다. 결론으로, KJ3는 혈관내피세포의 침습과 모세관 형성을 억제하고, 융모요막의 혈관생성을 억제하며, 동소이식 유방암백서에서 종양의 성장 및 VEGF의 발현을 억제시켜 혈관생성억제제로서 종양치료에 사용 될 수 있는 가능성을 제시하였고, 종양의 MMP-9의 발현을 증가시켜 종양의 침습과 전이과정에도 관여할 수 있을 것으로 사료된다.

[영문]Because angiogenesis or the formation of new blood vessels plays an important role in pathologic processes such as the growth and metastasis of tumors, blocking of this process may be a new strategy of cancer treatment. In this study, we evaluated the anti-angiogenic activity of KJ3, a new agent extracted from Embellisia chlamydospora KF208, by using in vitro and in vivo tests. The mechanism of this agent was also investigated by measuring the expression of matrix-metalloproteinase(MMP)-2, MMP-9 and vascular endothelial growth factor(VEGF) in experimental breast cancer animals. Trypan blue exclusion method was used for endothelial cell viability assay. Endothelial cell invasion assay and capillary tube formation assay were performed to evaluate the in vitro activity of anti-antiogenic effects. Chorioallantoic membrane(CAM) assay using chick embryo was examined for in vivo activity. C3H/HeJ mice with FM3A breast cancer cell lines were used to examine the anti-angiogenic activity of KJ3 in mice. 7 week old female C3H/HeJ mice were devided into 4 groups (n=24), and FM3A tumor tissues were inoculated in the subcutaneous area. Normal saline, KJ3, fumagillin and betulinic acid were injected intraperitoneally with a third of LD50, determined by FACS analysis. The size and weight of tumors and mice were measured on day 0, 2, 4 and 6. After sacrificing the mice, tumor masses were obtained, and MMP-2 and MMP-9 expression were measured by zymography and VEGF expression by ELISA. In endothelial cell viability assay, more than 95% of cells were viable under 20 ㎍/㎖ of KJ3. In endothelial cell invasion assay, cell invasion induced by 30 ng/㎖ bFGF was suppressed gradually by KJ3 in dose dependent manner. In vitro capillary tube formation assay showed that 10 ㎍/㎖ of KJ3 suppressed the tube formation of endothelial cells which was induced by bFGF 30 ng/㎖. In CAM assay, control group showed 10 % inhibition rate whereas KJ3 inoculated groups with 10, 100, 200 ug/egg showed 47, 64, 86 %, respectively. KJ3 treated group in CeH/HeJ mice with FM3A tumors, as well as the positive control groups treated with fumagillin and betulinic acid, showed statistically significant tumor growth inhibition effect on day 2, 4, and 6 (p<0.05). MMP-9 expression was increased significantly in KJ3, fumagillin, and betulinic acid treated groups compared with negative control group (p<0.05), but MMP-2 expression was not. KJ3 and betulinic acid treated groups showed significantly decreased expression of VEGF (p<0.05). In conclusion, KJ3 showed inhibitory effets to endothelial cell invasion, capillary tube formation, vascular formation in CAM, tumor growth and expression of VEGF, and so possibility of using as an angiogenesis inhibitor in tumor treatment. It also showed incresed tumor expression of MMP-9 and may be related with tumor invasion and metastasis.