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Analysis of radiation-induced analgesia-related proteins in an animal model of cancer pain

Other Titles
 암성 통증 동물 모델에서 방사선에 의한 통증 완화와 관련된 프로테오믹스 연구 
Authors
 박희철 
Issue Date
2004
Description
Dept. of Medicine/박사
Abstract
[한글] C3H/HeJ 웅성 마우스의 우측 발등에 암세포를 주입함으로써, 암세포의 침윤으로 뼈의 통증을 유발한 암성 통증 동물 모델을 수립하였다. 이 암성 통증 동물 모델을 이용하여 방사선에 의한 암성 통증의 완화 현상을 증명하고자 방사선 처치에 의해 유발되는 동물의 행동학적 변화를 관찰하고 분석하였다. 방사선에 의한 통증 완화의 기전을 파악하기 위하여, 종양의 형성과 방사선의 처치에 의해 변화하는 척수 부위의 통증 관련 단백질의 변화를 이차원전기영동과 단백질의 동정을 포함하는 프로테옴 분석 기법을 이용하여 분석하였다. 분석된 통증 관련 단백질을 확인하고자 Western blotting을 시도하였고 프로테옴 분석 기법을 이용하여 분석된 통증 관련 단백질의 2차적 신호전달을 통하여 발생하는 신경전달물질의 변화를 파악하기 위하여 면역조직화학염색을 시행하였다. 조직학적 관찰 결과 마우스의 발등에 암세포를 주입한 후 약 7-14일에 암세포의 뼈 침윤이 관찰되었고, 실험동물의 행동학적 변화를 통하여 시기적으로 암세포의 침윤과 암성 통증의 발생 시기가 일치함을 확인할 수 있었다. 방사선의 처치로 인한 암성 통증의 완화는 행동학적 변화의 관찰을 통하여 볼 때 약 3-7일 정도의 비교적 조기에 유도되었다. 그러나, 이 시기에 실험동물의 발등 부위에 발생한 암세포 침윤의 조직학적 변화는 없었다. 이를 통하여 방사선에 의한 암성 통증의 완화 현상은 암세포의 사멸과 직접적인 연관이 없음을 확인하였다. 프로테옴 분석 기법을 이용한 분석에서 107개의 척수 부위 단백질이 동정되었다. 종양의 형성 및 암세포의 침윤에 의하여 5배 이상 발현되는 수준이 변화하고, 이 후 방사선의 처치에 의하여 발현 수준의 변화가 반전된 단백질은 총 12개였다. 이 중 암성 통증 및 통증 전달 기작에 관여할 것으로 추정된 단백질은 4개로 secretagogin, syntenin, P2X purinoreceptor 6, Ca2+/calmodulin-dependent kinase 1 등이었다. 이들 단백질의 기능은 시냅스에서의 신호전달의 가속, Ca2+의 신호전달, 세포내 vesicle의 교통정리 등에 관여하는 것으로 여러 연구자들은 보고하였다. 또한, 면역조직화학염색을 통하여 이 들 단백질의 2차적 신호전달을 통하여 CGRP의 발현 수준이 종양의 형성 혹은 암세포의 침윤에 의하여 증가하고 방사선 처치에 의하여 감소하는 것으로 관찰되었다. CGRP 혹은 substance P 등은 염증으로 인한 통증에 흔히 관여하는 신경전달물질로, 이는 간접적으로 방사선에 의한 통증 완화가 종양 혹은 암세포 침윤 부위에서 방사선에 의한 염증의 완화와 관련된 것으로 추정하였다. 본 연구에서 수립한 암성 통증 동물 모델은 향후 방사선에 의한 통증 완화와 관련된 여러 기전을 연구하는데 큰 역할을 할 수 있을 것이며, 향후 방사선에 의한 통증 완화에서 본 연구에서 분석된 통증 관련 단백질의 정확한 작용 기작을 규명하기 위한 더 많은 연구가 필요하다.
[영문]To explore the mechanism of radiation-induced analgesia, we have developed the model of bone pain resulting from the invasion of cancer cells in C3H/HeJ mice. Using that animal model, the radiation-induced behavioral responses were analyzed to confirm the analgesic effect of radiation in our model. The differential expression of pain-related signals in the spinal cord was also analyzed using high-resolution 2-dimensional gel electrophoresis (2-DE) and mass spectrometry (MS). Validation of the radiation-induced analgesia-related proteins was attempted using Western blotting analysis and immunohistochemical staining. The invasion of cancer cells in the ipsilateral hind paw was detected from 7 days and was evident from 14 days after the transplant. The difference in the behavioral responses due to the mechanical and cold thermal stimulation was sustained from day 7. The radiation-induced analgesia was evident 3 days and 7 days after the radiotherapy, with increased pain threshold to the mechanical stimulation in animals given radiotherapy. The pain threshold in response to the cold thermal stimulations was also decreased with radiation at day 14. It was thought that the analgesic effect of radiation was not related with tumor regression because the erosion and destruction of the bone was not obviously reduced by radiation. A reference 2-DE map of spinal cord protein of normal mice (group N) was shown. One hundred and nineteen spots were analyzed by mass spectrometry and the identities of 107 spots were established using MALDI-TOF mass spectrometry. More than 5-fold increased expression caused by tumor formation was reversed by radiation on tumor bearing mice in 12 proteins. Among these proteins, the proteins which were thought to be related in the process of pain signaling were secretagogin, syntenin, P2X purinoreceptor 6 (P2X6) and Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase 1 (CaM kinase 1). P2X6 is supposed to be involved in the ATP-mediated fast synaptic transmission. Syntenin may have a role at the pathways that control vesicular trafficking. The putative function of CaM kinase 1 is believed to be involved in mediating transcriptional activation of gene expression in response to changes in intracellular Ca2+ concentration. Secretagogin also involves the Ca2+-binding characteristics. Western blotting analysis was attempted and the validation of protein was possible in P2X6. To examine the presynaptic neurotransmitter expression mediated by Ca2+-signaling cascade, the expression of calcitonin gene-related peptide (CGRP) and substance P was examined by immunohistochemical staining. The expression of CGRP which was increased by tumor formation was decreased by radiation. It is thought that the down-regulations of the proteins identified in the current study are involved in the mechanism of radiation-induced analgesia. The approach used in the current study will provide valuable tools for further studies in this field.
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1. College of Medicine (의과대학) > Dept. of Radiation Oncology (방사선종양학교실) > 3. Dissertation
Yonsei Authors
Park, Hee Cheul(박희철)
URI
https://ir.ymlib.yonsei.ac.kr/handle/22282913/122023
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