배양된 내이 혈관조의 형태학적 특성과 Na+-K+ ATPase의 활성도

Abstract

[한글]

내림프의 형성과 조절에 중요한 내이 혈관조의 실험모델을 확립하기 위하여 어린 백서에서 분리한 내이 혈관조를 explant하여 장기배양하였다. 사용한 배양액은 Earle's MEM, 20mM HEPES buffer, 2mM L-glutamine, 10㎎/l nonessential amino acid X-100, 0.4㎍/㎖ hydrocortizone, 10**-10 M cholera toxin, 5㎍/㎖의 insulin, 2×10**-9 M/L triiodothyronine, 5㎍/㎖ transferrine, 10% 소태아 혈청과 10ng/㎖ 표피성장인자를 보강하여 만든 배양액을 이용하였다. 형태학적 특성을 조사하기 위해 사이토케라틴 18 항체를 이용한 면역형광염색 양상과 주사 및 투과 전자현미경을 이용하여 미세구조를 관찰하고 배양된 세포의 생리적 기능을 알아보기 위해 Na**+ -K**+ ATPase 활성도를 조사하여 다음과 같은 결론을 얻었다.

1. 변연세포의 일차배양은 3주 이상까지 본래의 형태와 기능을 유지하는 것으로 관찰되었다.

2. 배양 변연세포가 상피세포에서 유래되었음을 사이토케라틴 18의 양성 반응을 통하여 확인할 수 있었다.

3. 배양된 변연세포의 주사 전자현미경소견은 미세융모가 발달된 직방형의 세포와 미세융모가 덜 발달된 길죽한 세포의 두 종류를 관찰할 수 있었다.

4. 배양된 변연세포의 투과 전자현미경소견은 세포내 미세구조들이 매우 발달된 세포와 그렇지 못한 두 종류의 세포로 구분이 되었고 기저쪽에 분비액이 찬공간들이 관찰되었고 세포막이 발달되었다.

5. 배양된 변연세포의 미세구조는 생체조직내의 변연세포의 미세구조와 동일한 소견을 보여주었을 뿐만 아니라 Na**+ -K**+ ATPase활성도도 생체조직과 동일한 반응을 보여 주었다.즉 배양 변연세포의 형태학적 특성과 Na**+ -K**+ ATPase 활성도를 기준으로 할 때 변연세포의 일차배양의 성공은 유용한 실험모델로서 이용이 가능하며 향후 내림프액의 생성과 그 조절, 전해질의 이동에 관한 연구에 기반을 제공한 것으로 사료되었다.

[영문]

To investigate an opportunity for the long-term study of the inner ear related to structural and functional integrity, the tissue of stria vascularis with spiral ligament was isolated from the Wistar rat cochlea and cultured using the explant-culture technique.

The following culture medium was used: EMEM with Hepes buffer, hydrocortisone(400ng/㎖), transferrin(5㎍/㎖), triiodothyronine(10**-9 M), cholera toxin(10**-10 M), insulin(5㎍/㎖), epidermal growthfactor(10ng/㎖). To characterize

the cells growing out from explant, immunofluorescence with cytokeratin(cytokeratin 18) and ultrastructual examination with scanning(SEM) and transmission eletron microscopes(TEM) were performed. Marginal cell function was investigated by expression of Na**+ -K**+ ATPase antisera against β2 subunit of rat Na**+ -K**+ ATPase and p-nitrophenyl phosphatase(p-NPP).

We were able to maintain the cultured cells for 3 weeks or more. We observed a monolayered marginal cells beyond 14 days in vitro(DIV) and the expression of cytokeratin 18 was especially enhanced in the cells glowing out from the explants. The cultured marginal cells were almost identical to in vivo cells on both ultrastructural features and Na**+ -K**+ ATPase activity. Scanning electron microphotographs showed that marginal cell layer consisted of two different cells: the polygonal cells with numerous microvilli; and the elongated cells with scanty microvilli. The polygonal cells with numerous microvilli shown by SEM contained numerous internal organelles such as well-developed rough endoplasmic reticulum(RER), free ribosomes, pinocytotic vesicles and mitochondria. They also showed a well-developed cytoplasmic infolding, basolaterally. The elongated cells with scanty microvilli had a less-developed cytoplasmic organelles. In addition, the basal side of cultured marginal cells was separated from underlying fibroblast-like cells by a fluid-filled space and some cytoplasmic extentions were also observed. Reaction products of potassium-dependent nitrophenyl phosphatase(K-NPPase) activity are fine & granular and they are located on the cytoplasmic side of the plasma membrane interdigitate processes.

Present results suggest that the primary explant culture technique is a reliable in-vitro model of the marginal cells.