DDRT-PCR 분석에 의한 acanthamoeba culbertsoni 감염 후 마우스에서 발현된 mRNA의 동정

Abstract

[한글]

자유생활아메바는 인체에 감염되어 원발성 수막뇌염이나 각막염을 일으키는 병원체로서 그 병변의 진행이 매우 빠르기 때문에 감염 초기의 정확한 진단이 중요하며, 아메바 감염 초기에 감염여부를 확인할 수 있는 핵산(DNA 또는 RNA) 수준의 진단법이 필요하다. 본 연구에서는 감염에 의해 발현되는 mRNA로부터 DNA를 증폭할 수 있는 differential display reverse transcription-polymerase chain reaction(DDRT-PCR)을 수행하여 감염군에서만 증폭되는 증폭산물을 확인함으로써 진단용 표지자 제조의 기초로 삼고자 했다.

Acanthamoeba culbertsoni(A. culbertsoni) 영양형 1×10**5 개를 감염시킨 마우스로부터 채취한 혈청과 아메바 용출물을 이용하여 ELISA를 수행한 결과 7∼10일에서 아메바에 대한 항체가가 급격히 증가하는 것을 관찰할 수 있었는데, 이때는 이미 마우스의 사망률

이 40∼60%에 이르러 항체가 형성되기 전 감염 초기에 진단할 수 있는 핵산수준의 진단이 필요함을 확인할 수 있었다. 또한, 아메바 감염 전(대조군)과 감염 후(감염군)에 동일한 마우스들로부터 채취한 혈액으로부터 정제한 mRNA를 주형으로 하여 역전사 중합효소 반응 및 중합효소연쇄반응을 수행한 DDRT-PCR 분석 결과 70개의 arbitrary 10-mer primer들 중 14개가 감염군에서 대조군과 차이가 나게 증폭된 DNA 증폭산물이 존재함을 관찰했다.

이들 14개의 arbitrary 10-mer primer와 3가지 one base-anchored oligo-dT^^11 M(M: A, C, 또는 G)의 조합을 이용한 DDRT-PCR의 증폭산물을 전기영동 분획을 실행하여 분석한 결과 arbitrary primer #209를 이용한 PCR 증폭산물 중 18개가 감염군에만 존재하는 분획

임이 관찰되었고, #210에 의해서 11개, #212에 의해서 35개, #219에 의해서 15개, #228에 의해서 19개, #232에 의해서23개, #234에 의해서 20개, #237에 의해서 17개, #250에 의해서 29개, #254에 의해서 24개, #265에 의해서 12개, #266에 의해서 16개, #268에 의해서 29개, 그리고 #269에 의해서 7개 등, 총 275개의 감염군에만 존재하는 분획을 확인할 수 있었다. 이들 감염군 분획들은 감염군 mRNA로부터 합성한 CDNA 탐침을 이용한 Southern slot blot hybridization에 의해 감염군에 존재하는 mRNA로부터 증폭된 PCR 산물임을 확인하였다.

결론적으로 자유생활아메바의 감염에 있어 핵산수준의 조기 진단을 위해, 표지자 제조에 유용한 14개의 arbitrary 10-mer primer를 확인하였고, 이 primer들을 이용하여 총 275개의 감염군에만 존재하는 전기영동 분획을 관찰할 수 있었는데, 이 중 조기 진단용 표지자 확보에 이용가능한 CDNA 증폭산물이 있을 것으로 사료되며, 이들의 동정 및 특성 분석을 위한 연구가 추후 수행되어야 할 것이다.

[영문]

A facultative parasite and pathogenic free-living amoeba, Acanthamoeba culbertsoni, has been known to frequently cause granulomatous amoebic meningoencephalitis and Acanthamoeba keratitis in human infection from a lot of sources such as fresh water, air conditioner, air, sewage, soil and so on. In this

study, identification of the DNA amplicons representing differentially expressed mRNAs in the blood cells of the mice infected with Acanthamoeba culbertsoni(1×10**5 ) was attempted via differential display reverse transcription-polymerase chain reaction(DDRT-PCR),which could be prospective candidates for developing DNA probe for the early diagnosis.

Based on ELISA analysis, antibody titer rose outstandingly on day 7 to 10 after the infection when the mortality of the infected mice already reached up to 57%. For DDRT-PCR analysis, seventy arbitrary 10-mer primers coupled with each one base-anchored oligo-dT^^11 M(M: A, C, or G)primer were screened and 14 of them revealed informative amplification profiles. The size of DDRT-PCR amplification products, counted in this study, were ranged from 100 to 2,500bp. Here are the summary of the 275 differentially displayed amplicons in the infection group, which

are prospective candidates of representing differentially expressed mRNA induced by amoebic infection: Fifteen specific amplicons were observed from PCR amplification with the combinations of the 3 anchored oligo-dT^^11 M and the arbitrary primer #209, 11 amplicons with #210, 35 amplicons with #212, 15 amplicons with #219, 19 amplicons with #228, 23 amplicons with #232, 20 amplicons with #234, 17 amplicons with #237, 29 amplicons with #250, 24 amplicons with #254, 12 amplicons with #265, 16 amplicons with #266, 29 arnplicons with #268, and 7 amplicons with# 269. It was verified that the observed 275 differentially displayed amplicons were amplified from mRNA of the infected mouse via Southern slot blot hybridization using cDNA probes synthesized from mRNA of the infected mouse.

Through DDRT-PCR analysis, several differentially displayed amplicons representing differentially expressed mRNA in the infection group were observed from the blood cells collected on the day 5 after the infection, which could be the candidates for developing the markers for the early diagnosis at the nucleic acid level. Further characterization of the observed 275 differentially amplified fragments should be Performed to identify the Prefer molecular genetic markers for the early diagnosis.