분자유전학적 표지자에 의한 자유생활아메바의 분류

Abstract

[한글]

인체에 각종 질병을 유발하는 자유생활아메바의 분류에 이용되어 온 형태학적, 생리학적, 생화학적, 면역학적 방법 모두가 객관적이고 보편 타당한 분류 방법이라 하기에는 미흡한 점이 지적되어 왔다. 최근의 분자생물학적 분석법의 발달에 따라 자유생활아메바의 분류에 분자유전학적방법이 이용되기 시작하였으나 분석에 필요한 DNA 탐침이나 프라이머의 제작에 요구되는 아메바 DNA 염기 구성에 관한 정보가 제한되어 있기 때문에 연구에 많은 어려움이 있다. 따라서 본 연구에서는 자유생활아메바의 DNA 염기 구성과는 무관하게 임의로 합성한 프라이머를 사용하는 random amplified polymorphic DNA (RAPD) 분석법을 이용하여 자유생활아메바의 분류에 적용할 수 있는 분자유전학적 표지자를 찾아내고, 그 유용성을 검정하였다.

본 연구에서는 임의의 10개의 염기로 합성된 프라이머를 이용하여 Acanthamoeba 속에 속하는 A.culbertsoni, A.hatchetti, A.triangularis, A.polyphaga와 국내 분리주인 YM-2,YM-3, YM-4, YM-5, 그리고 외국 분리주인 HOV를 대상으로 임의의 프라이머를 이용하여

중합효소 연쇄반응법을 시행한 후, 그 증폭산물을 agarose 겔 상에서 전기영동 후 관찰하였다. RAPD 분석의 결과 종간에 뚜렷한 차이를 보이는 분자유전학적 표지자를 찾아냈으며, 그 유용성을 알아보기 위해 기존에 사용되는 유사도 공식을 이용하여 시료간의 유사도를 계산하여 기존의 분류법과 비교하였다. 총 60개의 프라이머를 예비 실험에서 사용하여 그 중 중합효소 연쇄반응에 의해서 증폭산물의 수가 적어서 분석에 적합하지 않은 22개를 제외한 나머지 38개로 본실험을 시행하였다. 또한 유사도 값을 이용하여 종간 또는 분리주간에 비교 분석하였다.

실험 결과 종간 특이성을 보이는 증폭산물을 합성하는 프라이머는 모두 18개이었으며(UBC primer-211, 212, 220, 702, 703, 704, 706, 708, 716, 718, 723, 725, 726, 727, 730, 732, 733, 734), 이 중 분리주간에서도 특이성을 보이는 표지자를 나타내는 프라이머는 UBC primer-703, 704, 706, 708, 718, 725, 726, 730, 733으로 총 9개였다.

RAPD 분석법을 시행하여 종간 특이성을 보인 18개의 프라이머를 이용하여 합성된 증폭산물을 대상으로 유사도를 조사한 결과, A.culbertsoni는 A.hatchetti, A.triangularis, A.polyphaga와 유사도가 각각 0.300, 0.308, 0.313이었고, A.hatchetti, A.triangularis 간의 유사도는 0.838이었다. 국내 분리주 YM-2, -3, -4 간의 평균 유사도는 0.959이었고, YM-2, -3, -4와 A.hatchetti, A.triangularis 간의 평균 유사도는 0.832이었다. 국내 분리주 YM-5는 YM-2,-3,-4 간의 비교에서 평균 0.237의 유사도를 보인 반면, A.culbertsoni와는 0.857의 유사도를 보여, 유전적으로 다른 국내 분리주보다 A.culbertsoni와 유사함을 알 수 있었다.

이상의 결과로서 RAPD 분석법을 이용하여 자유생활아메바의 종 분류에 이용할 수 있는 프라이머 총 18개가 확인되었고, 본 연구에 사용된 시료간의 유사도 분포는 기존의 형태학적 분류 방법의 결과와 일치함이 관찰되었으며, 유사도를 근거로 볼 때 YM-5는 YM-2, -3, -4와는 명확히 다르므로 국내에는 YM-2, -3, -4와 YM-5로 구별될 수 있는 적어도 2종의 Acanthamoeba에 속하는 자유생활아메바가 있는 것으로 사료된다.

[영문]

Free-living amoebae, inhabited in moist soils, pond, fresh water, sewage, atmosphere, and swimming pool, are potential pathogens. They cause serious diseases including primary amoebic meningoencephalitis, amoebic conjuntivitis, multiple organ failure due to disseminated infection especially in immunocompromised persons. There have been several classification keys for these parasites such as morphological characters, physiologic features, biochemical markers, and immunological analysis. However, there have been some defects of those keys for

clear classification. Due to the recent development of molecular biological methods such as restriction fragment length polymorphism and polymerase chain reaction (PCR), molecular genetic marker systems have been tested to corroborate the

classification of the free-living amoebae. However, there has been limitation on the application of those methods since there has been limited amounts of information on the amoeba DNA which is required for preparing DNA probes and primers. To overcome this limitation, I tested a molecular genetic marker system of

random amplified polymorphic DNA (RAPD) which were amplified by PCR using an arbitrary primer instead of target specific primer.

To achieve the object of this experiment, four Previously established Acanthamoeba species(A. culbertsoni, A. polyphaga, A. triangularis, A. hatchetti), four Acanthamoeba isolates from Korea (YM-2, YM-3, YM-4, YM-5), and one isolate from America (HOV) were analyzed by RAPD-PCR using an arbitrary decamer primers purchased from Dr. John B. Hobbs in the Biotechnology Laboratory at the University of British Columbia (UBC), Canada. Thirty eight arbitrary primers out of 60 tested in the preliminary analysis were used for RAPD-PCR with selected amoeba genomic DNA in this study. Based on the observed amplification fragment polymorphism, similarity index was calculated between pair-wisely compared samples to compare the obtained results with conventional classification.

The obtained results were as followed:

1. There were 18 Primers (UBC primer-211, 212, 220, 702, 703, 704, 706, 708, 716, 718, 723, 725, 726, 727, 730, 732, 733, 734) which produced DNA amplification profiles revealing clear differences among 4 species. Nine of them (UBC primer-703,

704, 706, 708, 718, 725, 726, 730, 733) also produced DNA amplification profiles which included some isolate-specific amplification products.

2. The pair-wise similarity index between A. culbertsoni and other species (i.e., A. hatchetti, A. triangulatis, A. polyphaga) were 0.300, 0.308, and 0.313, respectively. Similarity index between A. hatchetti and A. triangularis was 0.833. The mean similarity index among 3 Korean isolates (YM-2,-3,-4) was 0.959 and that was 0.832 between them and A. hatchetti, A. triangularis. The mean similarity index between YM-5 and other Korean isolates was 0.237, but the similarity index between

YM-5 and A. culbertsoni was 0.857, which suggests that YM-5 is genetically more similar to A. culbertsoni than other Korean isolates. Phenogram reconstructed by uniweighted pairgroup method with arithmetic mean mathod revealed that there are two groups: one group consists of A.hatchetti, A. triangularis, and 3 Korean

isolates (YM-2,-3,-4), and another group consists of A. culbertsoni, A. polyphaga, HOV, and YM-5. In conclusion, 18 arbitrary primers which could be useful for the classification of Acanthamoeba spp. were identified. The similarity index,

estimated on the basis of RAPD markers, revealed correspondence with the morphological classification. Based on the estimates of similarity index among 4 Korean isolates, there may be at least 2 distinct Acanthamoeba spp. in Korea.