적혈구형 포도당 운반체(GLUT1)에 대한 antisense RNA를 이용한 종양세포내 포도당 흡수변화

Abstract

[한글]

포도당은 포유동물의 중요한 대사연료이며, 세포 원형질막에 존재하는 포도당 운반체(glucose transporters, GLUTs)는 facilitative diffusion 기전에 의해 세포외부에 고농도로 존재하는 포도당을 세포내로 운반하는 막 단백질로서 동일종내에서 각 조직에 따라 분

포하는 형(type)이 양적으로는 미량이지만 중복되기도 하나 그 주요 분포형은 서로 다르다고 알려져 있다.

최근 연구에 따르면 포도당 운반체는 5종류가 보고되어 있으며 이 중 세포성장 상태와 매우 밀접한 관련이 있는 형이 적혈구형 포도당 운반체(GLUTI)로서 암유전자 활성이나 과도한 성장인자(growth factor) 표현에 의해 유도되는 증식상태에 있는 세포에 포도당 공

급을 담당하는 중요한 세포막 단백질이다.

본 연구에서는 GLUTI mRNA에 대한 antisense RNA를 표현하는 GLUTI antisense RNA 구성체를 pMAM vector에 삽입하여 pMAM-GLUTI(rev)을 제조하여 N-ras 암유전자에 의해 암세포로 변형된 NIH 3T3세포내에 transfection 시킨 다음 dexamethasone으로 GLUTI에 대한 antisense RNA의 표현을 유발시키면서 암세포로 변형된 NIH 3T3 세포의 성장 및 특성 변화를 관찰하여 다음과 같은 결과를 얻었다.

1. pBN-ras로 transfection 시킨 NIH 3T3 세포는 배양시 형태학적으로 전형적인 암세포의 모양을 보이고, soft agar상에서 colony를 형성하였으며, 이 세포의 염색체내에 N-ras의 exon 2부위가 PCR법에 의해 증폭되는 사실로 미루어 보아 이 세포는 N-ras 암유전자에 의해 암세포로 변형되었음을 확인하였다.

2. N-ras에 의해 암세포로 변형된 NIH 3T3 세포의 2-deoxy-D-[1- (3)**H]-glucose 운반능력은 대조군 NlH 3T3 세포에 비하여 반응시작 4분 후에 2.5배, 5분 후 4.5배, 6분 후 6.0배 증가되었으며 암세포내 GLUTI mRNA양은 대조군에 비해 2.5배 증가되었다.

3. GLUTI에 대한 antisense RNA를 전사시킬 수 있는 DNA를 제조하기 위하여 GLUTlcDNA(1.8kb)를 포유동물 세포에서 dexamethasone에 의해 표현이 유도되는 MMTV-LTR을 promoter로 가진 vector인 pMAM의 SalI 절단부위에 역방향으로 subcloning하여 삽입된 방향을 KPnI, Ncol, EcoRl 및 SalI으로 확인하고 pMAM-GLUT1 (rev)이라 명명하였다. 이 vector를 N-ras에 의해 변형된 NIH 3T3 암세포에 transfection 시킨 후 dexamethasone을 처리하여 GLUT1 antisense RNA 크기(2.4kb)에 해당하는 RNA가 표현되는 것을 확인하였다.

4. pMAM-GLUTI(rev)을 transfection 시킨 NIH 3T3 암세포를 두 군으로 나누어 한 군은 dexamethasone으로 GLUTI antisense RNA의 표현을 유도시키고 나머지 군은 유도시키지 않은 대조군으로 하여, 포도당이 운반되는 양은 유도군에서는 1.97±0.13pmo1e glucose/10*

*5 cells(2021±106cpm/10**5 cells)로 대조군에 비해 (3.36±0.54pmole glucose/10**5 cells, 3692±591cpm/10**5 cells) 45% 감소되었다.

5. Soft agar상에서 antisense RNA 표현을 유도시킨 군에서는 직경이 50㎛ 이상인 colony 수가 20±3.4개/60 mm**2로 antisense RNA의 표현을 유도시키지 않은 대조군(32±2.8개/60mm**2 )에 비해 40% 감소되었으며, 유도군에서 관찰된 colony의 크기가 대조군에 비

해 전체적으로 작았다. 이러한 결과를 종합해 볼 때 GLUTI antisense RNA가 표현됨으로써 암세포내로 포도당 운반이 감소되고, soft agar assay에서 변형능력이 감소되는 사실로 미루어 보아 세포내에서 GLUTI antisense RNA가 GLUTI mRNA와 결합하여 GLUTI mRNA가 translation하는 과정이 억제되어 암세포가 필요로 하는 포도당을 운반시키는 포도당 운반체의 양이 감소되었기 때문이라고 사료된다.

[영문]

Sereval studies have shown that transport of glucose in all tissues is mediated by a family of structurally related facilitative glucose carriers that have distinct but overlaping tissue distributions. Recently, five types of glucose transporter were identified in mammalian cells. One of these GLUTs, the GLUTl, which is known as RBC type g1ucose transporter has been known to be closely related to cellular growth states.

GLUTI is expressed in most cells and thought to be responsible for "housekeeping" levels of glucose transport. The rate of glucose transport via GLUTl is known to be increased under conditions such as transformation process or serum stimulation of

cells. This unique characteristics of GLUTl expression may Provide one of the possible ways to reduce the growth of the cell undergoing cellular transformation.

In this study, NIH 3T3 cell was transformed by ras oncogene and the presence of ras in the host chromosome was confirmed by polymerase chain reaction using primers that will amplify the exon 2 region of ras. This cell line showed increased glucose

transport, GLUTI mRNA content and the ability to form colonies in soft agar. An expression vector that will express the antisense RNA against the GLUTl mRNA was constructed and named pMAM-GLUTI (rev). To investigate the possibility of application of antisense RNA against the RBC type GLUT1 for suppression of tumor cell growth, pMAM-GLUTI (rev) was transfected into NIH 3T3 cells transformed by ras. The expression of antisense RNA was induced by dexamethasone and confirmed by Northern blot analysis. The GLUTl antisense RNA reduced the amount of glucose transported into cells by 45% compared to control group. The number of colonies sizing over 50㎛ grown in the soft agar in antisense expression group was reduced to 20±3.4 compared to control group(32 ±2.8/60 mm**2 ). From these results, the expression of GLUTl antisense RNA reduce the glucose transport and transforming

potential in soft agar by blocking expression of GLUTl mRNA with in the ras transformed NIH 3T3 cell line.