베체트병 환자에서 혈관 내피세포에 대한 순환항체 및 손상에 관한 연구

Abstract

[한글]

베체트병은 만성적으로 여러 장기를 침범하며 반복적인 염증 반응을 보이는 질환으로 아직까지 임상증상 외에 확실한 진단법이 없으며 병인에서도 뚜렷한 정설이 확립되어 있지 않다. 최근 혈관염을 보이는 여러 자가면역질환에서 혈관 내피세포에 대한 순환 항체가 보고되고 있고 이 항체가 직간접적으로 내피세포 손상을 유발할 수 있음이 보고되고 있다. 혈관손상이 빈번히 동반되며, 혈관염이 주된 병리학적 소견인 베체트병에서도 혈관 내피세포가 면역반응의 표적이 되어 발병에 중요한 역할을 할 것으로 생각된다.

본 연구에서 베체트병 환자의 혈청내에 혈관 내피세포에 대한 항체가 존재하는지를 알아보기 위해 배양한 인체진피 미세혈관 내피세포(human dermal microvascular endothelial cells: HDMEC)에 interleukin 1α(IL-1α), tumor necrosis factor α(TNFα)와 interf

eron-γ(IFN-γ) 등의 생물학적 반응 조절물질(biological response modifier: BRM)을 처치하고 효소면역 표지법, 젤전기영동 및 면역블롯법을 이용하여 HDMEC에 대한 순환항체의 검출과 혈관 내피세포 표면항원을 관찰하였다. 또한 혈청내에 혈관 내피세포 손상 인자의 존재유무를 관찰하기 위해 배양한 HDMEC에 정상대조군 및 베체트병 환자의 혈청을 적정시간 처리한 후 주사 및 투과 전자현미경 검사를 이용하여 형태학적 변화를 비교 관찰하였고, 세포독성 실험을 통해 베체트병 환자의 순환항체에 의한 HDMEC의 용해능을 측정하여 다음과 같은 결과를 얻었다.

1. 베체트병 환자에서 HDMEC 표면항원에 반응하는 혈청항체는 주로 IgM이었다.

2. 완전형 베체트병 환자 40명중 8명(20%)의 혈청에서 자극하지 않은 HDMEC에 대한 IgM항체를 검출할 수 있었다.

3. 완전형 베체트병 환자 40명중 8명(20%)의 혈청에서 IFN-γ를 처치한 후 처치전에 비해 HDMEC에 대한 IgM 항체가의 증가를 관찰할 수 있었다.

4. 베체트병 환자의 혈청에서 자극하지 않은 HDMEC과 IL-1α, TNFα 또는 IFN-γ를 처치하고 4시간, 24시간 및 48시간 배양한 HDMEC에 대한 IgG 항체를 검출할 수 없었다.

5. IgM 항체 양성을 보인 베체트병 환자의 혈청은 Western 블롯검사상 44kDa의 HDMEC 표면 항원과 반응하였으며, 44kDa의 단백질대는 배양한 인체 제대정맥 내피세포(human umbilical vein endothelial cells: HUVEC)에서도 관찰되었으나 섬유아세포, A43l, SK-MEL_2 세포에서는 관찰할 수 없었다.

6. 주사 전자현미경 검사상 IFN-γ를 전처치한 후 베체트병 환자의 활동기 혈청을 처리한 HDMEC에서 세포표면의 중심부로부터 외부로 팽창돌출되는 부위가 명확히 관찰되었다. 또한 정상혈청을 처치한 HDMEC에 비해 세포간의 경계가 불명확하고, 세포표면에 미세융모돌출이 뚜렷한 세포들이 많았다.

7. 투과 전자현미경 검사상 베체트병 환자의 활동기 혈청을 처리한 HDMEC에서 정상혈청을 처리한 HDMEC에 비하여 세포용해 현상이 뚜렷이 관찰되었다. 그러나 정상혈청을 처리한 HDMEC에서도 매우 드물지만 세포용해 현상을 관찰할 수 있었다. 베체트병 환자의 혈청을 처리한 HDMEC의 경우 융모돌기, 세포흡수소낭, myelin 유사소체, 지질유사물질 침착 및 다양한 리소좀 구조들을 흔히 관찰할 수 있었다.

8. 보체중개성 세포독성 검사상 베체트병 환자 혈청의 45%에서 유의한 세포용해능이 관찰되었으며, IL-1α, TNFα와 IFN-γ등의 전처치후 세포용해능의 유의한 변화를 관찰할 수 없었다.

9. 항체의존성 세포중개성 세포독성 검사상 베체트병 환자 일부 혈청에서 세포용해능이 관찰되었으며, IL-1α와 IFN-γ의 전처치에 의해 세포용해능이 변화되지 않았다.

이상의 결과로 베체트병 환자의 활동기 혈청내에 혈관 내피세포에 대한 IgM항체와 혈관 내피세포를 손상시키는 인자가 존재하고 대부분 보체중개성 세포독성 기전에 의해 손상이 유발됨을 알 수 있었으며, 이는 베체트병의 혈관염이 혈관 내피세포의 표면에 존재하는 항원에 대한 항체에 의해 혈관손상이 유발되어 발병할 가능성이 있음을 시사한다.

[영문]

Behcet's disease is a chronic, multisystemic disorder characterized by recurrent inflammatory reaction. Diagnosis is done not by laboratory findings but by clinical symptoms. The pathogenesis of Behcet's disease has net been clarified. Recently, antiendothelial cell antibody has been detected in the sera of patients of autoimmune diseases showing vasculitis, and it is assumed that it can induce damage to the endothelial cells. Thus we postulate that antiendothelial cell antibody may play an important role in the pathogenesis of Behcet's disease which shows frequent vascular damage and vasculitis features clinicopathologically.

We have detected antiendothelial cell antibody in the sera of Behcet's disease by ELISA, SDS-PAGE and immunoblotting, and have observed the morphologic changes in cultured HDMEC by electron microscope after treating the HDMEC with the sera of normal control and Behcet's disease. The cytolysis of HDMEC was measured by cytotoxicity assay.

The results are as follows;

1. IgM antibody reacts with the HDMEC surface antigen in Behcet's disease patients.

2. Eight out of fourty(20%) of the complete type of Behcet's disease patients showed IgM antibodies when HDMEC was not stimulated.

3. Eight out of fourty of the complete type of Behcet's disease patients showed increase in IgM antibody titers after IFN-γ pretreatment and culture for 48 hours.

4. IgG antibodies against unstimulated HDMEC or HDMEC stimulated with IL-lα, TNFα and IFN-γ for 4, 24, 48hours could not be detected.

5. In Western blotting IgM positive Behcet's disease serum reacted with 44kDa HDMEC surface antigen. The reactivity to 44kDa protein band of Behcet's disease serum was observed only in cultured HDMEC but not in fibroblasts, A43l, SK-MEL_2 cells.

6. In scanning electron microscopy study, HDMEC pretreated with IFN-γ and Behcet's disease serum showed a definite protuberance of the cell surface from the center. In addition, their cell borders were not clear and there were many microvilli like protuberances.

7 In transmission electron microscopy study, there was definite cytolysis in HDMEC pretreated with Behcet's disease serum in comparison to normal serum. However, some cytolysis could be observed in HDMEC pretreated with normal serum. HDMEC pretreated with Behcet's disease serum showed relatively many villous

projections, pinocytotic vesicles, myelin-like bodies, lipid-like materials, and various lysosomal structures.

8. Fourty five percent of Behcet's disease patients showed significant cytolysis in the complement dependent cytotoxicity assay. Pretreatment with IL-lα, TNFα and IFN-γ had no effect on the cytolysis.

9. Twenty percent of Behcet's disease patients showed cytolysis in the antibody dependent cell mediated cytotoxicity assay and pretreatment with IL-lα and IFN-γ had no effect on the cytolysis.

The results indicate that there are antiendothelial cell IgM antibodies and other factors causing damage to endothelial cells. Above findings suggest that vasculitis in Behcet's disease may becaused by vascular damage due to antibodies against antigens on the surface of endothelial cells.