대장균 세포에서 사람의 혈액응고인자 Ⅷ의 표현유도 및 분리

Abstract

[한글]

혈액응고인자 Ⅷ (factor Ⅷ)은 혈액응고인자 Ⅸ이 혈액응고인자 Ⅹ을 활성화시키는 과정을 촉진시키는 보조인자로서 혈장내에 200 ng/ml정도의 낮은 농도로 존재한다. 혈우병 A는 혈액내 factor Ⅷ이 부족하여 생기는 질병으로서 현재 이에 대한 유전자 치료가 활발히 연구되고 있다.

혈우병 A에 대한 연구를 하기위하여는 Factor Ⅷ에 대한 플리 클론 항체는 매우 필요한 것이나 동물에게서 면역반응을 일으킬 수 있을 정도의 순수한 factor Ⅷ 단백질율 분리하기는 어려운 일이다. 그러므로 대장균에서 factor Ⅷ 단백질의 일부를 표현시켜 이를

순수 분리하여 항원으로 이용하고자하였다.

원핵세포 표현 vector인 pGEX 4T-3에 factor Ⅷ cDNA의 A1과 A2 domain의 일부(아미노산 번호 187-560)를 coding하는 유전자를 삽입하여 glutathione S-transferase(GST)와 융합단백질을 만들 수있는 plaamid, pGEXⅧ을 만들고 이를 이용하여 대장균을 형질전환 시킨 후 0.1 mM isopropyl thiogalactoside로 71kDa의 GST-factor Ⅷ 단백질의 표현을 유도하였다. 표현된 단백질이 GST-factor Ⅷ 융합 단백질임을 전기영동, western blot을 통해 확인하고 이를 gel로부터 electroelution을 이용하여 순수 분리 하였다.

[영문]

Human blood coagulation factor Ⅷ(factor Ⅷ) that functions as a cofactor for the activation of factor Ⅹ by activated factor Ⅸ in coagulation cascade, is present at very low level (200 ng/ml) in plasma. Recently the studies on gene therapy for hemophilia A caused by the deficiency of factor Ⅷ are actively encouraged.

The polyclonal antibody for factor Ⅷ is essential in studying hemophilia A and it is important to ger purified factor Ⅷ for immunizing animals. Therefore the factor Ⅷ protein was induced in E. coli and purified.

The part of factor Ⅷ cDNA that encodes a part of A1 and A2 domain of factor Ⅷ(aminoacid number 187-560) was inserted into prokaryotic expression vector, pGEX 4T-3 plasmids were introduced into E. coli(DH5a) and a fusion protein (GST-factor Ⅷ) was induced by IPTG. The induced protein was confirmed by SDS-PAGE, western blot and immunostaining and purified by electroelution.