백서 간장세포내 ATP-citrate lyase 유전자의 exon부위 결정

Abstract

[한글]

ATP-citrate lyase(ACL)는 mitochondria에서 acetyl CoA와 oxaloacetate가 결 합하여 형성된 citrate가 세포질 내로 이동하면 ATP존재하에 alcetyI CoA와 oxaloacetate를 생성하는 반응을 촉매하는 효소로서 세포질 내에서 일어나는 지방산합성과 cholesterol 합성

에 acetyl CoA를 공급한다(Kornacker 및 Lowenstein, 1965).이 효소는 분자량이 110kDa인 동일한 네개의 소단위로 구성되어 있다(Linn 및 Srere, 1979). 백서를 장시간 굶긴 후 고함수탄소식이를 공급할 경우간장세포에서 지 방 합성 효소들[fatty acid synthase (Kat

surada등, 1990a; Kim등,1992b), acetyl CoA carbofylase(Katsurada등 , 1990b), glucose-6-phosphate dehydrogenate(Katsurada등, 1989), malic enzyme(Fukuda 등, 1990)]이 증가하는데 이 때 ACL의 활성은 20-30배 증가하며 이는 효소의 양적 증가에 비례하고, 양적 증가는 이효소의 mRNA양적 증가와 일치하며 mRNA의 양적 증가는 핵내 ACL유전자의전사증가에 기인하는 것으로 보고되었다 (Whang및 Kim, 1978; Fukuda등. 1992;Kim등, 1992a).

또한, 지방 합성에 관여하는 다른 효소들 역시 고함수탄소식이 투여로 이들 효소의 유전자 발현이 거의 유사한 양상으로 증가된다는 사실이 보고 되 어 있다(Iritani등, 1992).

ACL의 효소활성 조절부위의 인산화에 대한 연구도 보고되어 있어 CAMP에 반응하여 인산화되는 A-site와 cAMP와 무관하게 인산화되는 B-site가 있으며(Ramakrishna등, 19ag), A-site의 인산화에 의해 효소의 활성이 저하되기도 하지만(Houston및 Nimmo,1985)인산화에 의한 효소 활성 조절보다 효소의 양적변화에 의한 조절이 중요 역할을 한다을 알려져 왔다.

최근에 이르러 이들 지방 합성 효소들의 유전자상 발현 조절기 전에 대한연구는 활발히 진행되고 있으며, fatty acid synthase(Amy등, 1992)와 acetyl CoA carboxylase(Luo등, 1989)의 유전자가 cloning되었고 promoter부위에 관한 연구도 진행되고 있다. ACL의 경우 백서와 사람의 complementary DNA(cDNA)가 cloning되어 염기 서열이 밝혀져 있지만(Elshourbagy등, 1990; Park등, 1991; Elshourbagy등,1992) 유전자상의 econ-intron 구조는 최근에 일부가 밝혀졌을뿐(Kim등, 1994)아직 완전히 밝혀져 있지 않다 따라서 본 연구에서는 ACL유전자를 cloning하고 이 유전자의 exon위치와 exon-intron 이행부위를 결정하기 위하여 이 실험을 계획 했다.

[영문]

Citrate transported from mitochondria to cytosol is cleaved into acetyl CoA and oxaloacetate by ATP-citrate lyase far lipogenesis and cholesterologenesis. The 4.3kb complementary DNA(cDNA) of ATP-citrate lyase from rat and human were cloned and its full sequences were reported . This study was designed to identify the

structure of the rat ATP-citrate lyase gene, including the locations of axons and sequences at exon-intron junctions.

Five λACL clones containing the ATP-citrate lyase gene were isolated from the rat genomic library. These clones contained additional 35kb of ATP-citrate lyase genomic DNA(gDNA) from the 3'end of the λACL8 clone which was 13.6kb including promoter and eaxons of ATP-citrate lyase gene (Kim et.al., 1994). Comparing the DNA sequences between the gDNA and cDNA, it was revealed that 16 exons from exon 8 to exon 23 occupying 1.9kb scattered on 35kb gDNA, and that the sequences of the exons were consistent with the cBNA sequences previously reported by Elshourbagy et.

al.(1990) except one site of codon 500. The sequence of codon 500 was 'GTG' in cDNA as well as gDNA instead of 'GTA' in published cDNA sequence data, but both were degenerated codon for valine. All introns between exons began with 'GT' and ended with 'AG'.

There were some variations in restriction site among Ⅱ rats, that is, the HindⅢ polymorphism exists in the intros 10, and it seems that the repetitive sequences widely dispersed on the chromosomes are present in the intron 11