나환자 피부생검 조직에서 중합효소 연쇄반응을 이용한 Mycobacterium leprae의 검출

Abstract

[한글]

나병을 진단하기 위해서는 병변에서 원인균인 나균(Mycobacteriumleprae)을 검출하는 것이 중요하지만 나균은 배양이 불가능하므로 현미경 검경에 의한 항산균의 관찰이나 조직병리 검사, 면역학적 검사, 또는 DNA probe를 이용하는 방법등이 시도되고 있다. 그러나 민감도와 특이도에 있어서 만족할 만한 진단은 아직 잘 이루어지지 않고 있다. 최근 중합효소 연쇄반응이 DNA의 검출에 있어서 특이도와 민감도가 높은 기법으로 알려지면서 이를 이용하여 나균을 검출하려는 시도가 있지만, 아직 나환자의 피부조직을 이용하여 중합효소 연쇄반응을 시행하고, 기존의 다른 진단방법들과의 비교를 통하여 그 진단적 가치를 연구한 보고는 미흡한 상태이다. 따라서 본 연구에서는 나병이 의심되는 102명의 환자의 피부생검 조직에서, 나균 DNA에 약 28 copy가 존재하는 것으로 알려진 repetitive sequence를 표적으로 하여 372 bp DNA단편을 증폭시키는 중합효소 연쇄반응을 시행하여, 그 결과를 항산균 현미경 검경에 의한 세균지수 및 조직병리 소견과 비교함으로써 나병의 진단에 있어서 중합효소 연쇄반응의 응용가능성을 평가하고자 하였으며 다음과 같은 결과를 얻었다.

1. M.leprae를 포함한 7종의 mycobacteria 및 10종의 세균, 그리고 나병과 5종의 다른 피부질환 조직에서 DNA를 추출하여 중합효소 연쇄반응을 시행한 결과 372bp DNA단편이 M.leprae에서만 특이하게 증폭되었다.

2. Armadillo에서 증식된 M.leprae의 DNA를 분리하고 중합효소 연쇄반응을 이용하여 증폭한 372bp DNA단편을 ^^32P로 표지한후, 가검물로부터 증폭된 372bp DNA단편과 dotblothybridization을 시행한 결과, 가검물로부터 PCR에 의해 증폭된 DNA단편이 M.leprae DNA에

서 증폭된 DNA 단편과 일치함을 보여, 가검물에M.leprae가 존재함을 알 수 있었다.

3.마우스의 footpad에서 분리한 M.leprae의 수를 산정한 후 10배수 계단희석하여 bead-beating법으로 DNA를 분리하고 중합효소 연쇄반응을 시행한 결과, 균수가 1인 경우까지도 증폭된 372bp DNA단편을 관찰할 수 있었다.

4. 현미경 검경상 항산균을 발견할 수 있었던 87례 중 84례(97%)에서 PCR 양성이었다.

5. 조직병리 소견상 나병을 의심할 수 있었던 97례 중 92례(95%)에서 PCR 양성이었다.

6. 현미경 검경상 항산균을 발견할 수 없었던 15례 중 11례(74%)에서 PCR 양성이었다. 이들 15례 중에서 특히 조직병리 소견상으로도 나병의 증거를 찾을 수 없었던 5례 중 3례에서 PCR 양성이었다.

이상의 결과로 보아 M.leprae의 repetitive sequence어서 372 bp DNA단편을 증폭하는 중합효소 연쇄반응은 가검물에 존재하는 M.leprae를 신속하고 특이하게 검출할수 있으며 민감도에 있어서도 우수하였다. 특히 조직병리 소견상 또는 현미경 검경상 항산균을 검출

하지 못하는 경우의 진단에 매우 유용한 보조적 진단 방법이 될 수 있을 것으로 생각된다.

[영문]

Recent development in the polymerase chain reaction (PCR) technology has brought an extraodinary opportunity for the rapid detection of Mycobacteriumleprae in clinical specimens for the diagnosis of leprosy. DNA segment which is specific to M.leprae was detectable in matter of hours and DNA from one organism appeared positive by PCR. However, the PCR tool has not been evaluated using clinical specimens from leprosy patients and controls. This study was, therefore, initiated to evaluate the PCR tool for the diagnisis of leprosy. The primers amplifying the

372 bp segment of repetitive sequence of M.leprae DNA were used in PCR. Skin biopsy specimens from 102 leprasy patients and controls were examined for the presence of M.leprae DNA by PCR and the results were then compared with microscopic and histopathologic findings.

The results obtained were as follows:

1. As a result of PCR after DNA preparation of M.leprae, six other mycobacteria, ten other bacteria, and skin from leprosy patient with 5 other skin biopsy tissues, the 372 bp DNA fragment based on repetitive sequence was specifically amplified from M.leprae.

2. Dotblothybridization of PCR products from skin biopsy specimens with 32**P -labeled 372 bp DNA fragmentprepared M.leprae chromosomal DNA as a probe showed a positive reaction, thus indicating that the PCR amplified 372 bp DNA from skin biopsy specimens were derived from M.leprae.

3. As a result of PCR after DNA preparation of 10-fold diluted M.leprae from mouse footpadin order to determine sensitivity, PCR gave a positive result as low as one organism of M.leprae.

4. Eighty four (97%) of 87 skin biopsy specimens in which acid-fast bacilli were found under microscopic examinations had positive PCR results.

5. Ninety two (95%) of 97 skin biopsy specimens which had histopathologic evidences of leprosy had positive PCR results.

6. Eleven (73%) of 15 skin biopsy specimens in which acid-fast bacilli were not found under microscopic examinations had positive PCR results. Especially three of five cases had positive PCR results, which had neither histopathologic nor microscopic evidences of leprosy.

These results thus showed that the PCR method amplifying 372 bp fragment of repetitive sequence was highly sensitive and specific in detecting the M.leprae DNA in skin biopsy specimens, thus PCR may be a useful tool as an additive diagnostic method, especially for the cases that microscopic and histopathologic findings are

not definite.