백혈병 세포로부터 N-ras exon 2의 cloning

Abstract

[한글]

백혈병은 예로부터 잘 알려진 질환으로서 현재도 범세계적으로 많이 발생하는 질환의 하나이지만 아직도 예후가 나쁜 질환 중의 하나로 알려져 있다. 적정한 치료 방법의 개발을 위해서는 병인에 대한 더 많은 연구가 필요하며, 최근의 분자 생물학의 발전에 따라 백혈병의 병인을 유전자 상에서 해명해 보려는 많은 시도가 이루어지고 있다. 본 연구에서는 백혈병과 상관이 있다고 알려진 암유전자중 N-ras 유전자의 exon 2 부위를 종합효소 연쇄반응(polymeraae chain reaction, PCR)으로 증폭하고 vector에 삽입시킨 후 cloning 하여 N-ras 유전자의 변이 여부를 밝히는 기본 재료를 제공하고자 하였다.

세브란스 병원에 내원하여 백혈병으로 확진된 환자로부터 혈액을 채취하여 혈액 세포로부터 분리한 DNA를 template로 사용하고, N-ras exon 2의 말단 부위를 변형시켜 제조한 primer를 이용하여 종합효소 연쇄반응을 실시한 다음 전기영동을 시행한 결과 백혈병 환자로부터 유래한 N-ras의 exon 2 부위가 증폭되었음을 확인하였다.

증폭된 N-ras exon 2 부위를 분리하여 EcoRI과 BamHI 효소로 동시에 절단한 후 pGEMEXl vector의 EcoRI과 BamHI 부위에 결합시켜 N-ras exon 2 부위가 삽입된 재연합 plasmid를 얻었다.

이것을 Escherichia coli(E. coli)에 형질 전환(transformation)시켜 대량으로 자라게 하고 plasmid를 분리하여 EcoRI과 BamHI 효소로 다시 절단한 걸과 전기영동상에서 결합되지 않은 상태의 vector와 insert 두 band가 유리되어 insert가 제대로 삽입되었음이 확인되었고, PvuⅡ 효소로 절단한 결과 전기영동상에서 한 개의 band만 나타난 것으로 보아 vector에는 없으나 insert의 한 곳에 존재하는 PvuⅡ 인식 염기 서열을 가진 plasmid임이 확인되었다.

Cloning된 vector, cloning후 EcoRI과 BamHI으로 동시에 절단한 DNA,그리고 insert를 삽입시키지 않은 pGEMEXl 그 자체만을 각각 전기영동하고, Southern blotting하여 pGN-ras로부터 얻은 N-ras exon 2 를 probe로 사용하여 hybridization을 시행한 결과 insert가 있는 곳에서만 방사성 동위원소에 의한 band가 감지되어 pGEMEXl속에 삽입된 insert가 N-ras exon 2와 일치함을 확인하였다.

이와 같이 백혈병 세포의 N-ras exon 2 부위를 종합효소 연쇄반응으로 증폭하고 이를 cloning하였으며, 앞으로 이 재연합 plasmid는 백혈병 세포에 존재하는 N-ras exon 2의 변이 여부와, 이 변이가 백혈병의 발생 또는 진행과 어떤 상관 관계가 있는지 밝혀나가는데에 기초 자료가 될 수 있을 것으로 사료된다.

[영문]

Human leukemia occurs widely in the world and is known as one of the malignant diseases for a long time. For the development of the method for the treatment of leukemia, more research on the etiology and pathogenesis of the disease is necessary. Recently many attempts have been made to understand the causes of the disease on the gene level with the development of molecular biology. In the present study, cloning of codon 61 locus of N-ras oncogene in human leukemia cells was done for the future analysis on the mutational change of the gene.

N-ras exon 2 locus in human leukemic cells was amplified by polymerase chain reaction, using the template DNA prepared from peripheral blood of leukemic patients admitted to the Severance Hospital. The primers complementary to the both terminals of N-ras exon 2 were synthesized after a slight modification to have

restriction sites. The amplified N-ras exon 2 locus which has EcoRl and BamHI restriction sites was isolated and inserted into pGEMEXl vector.

The recombinant plasmids were transfected into E. coli. cells and cultured. The plasmids were isolated and digested wish EcoRI and BamHI followed by agarose gel electrophoresis. Two DNA bands corresponding to the vector and the insert DNA were shown. The digestion of the plasmid with PuvuII showed one DNA band, indicating the presence of only one PvuII site in the insert.

Southern blot hybridization of the cloned plasmid digested with the restriction enzymes using a probe for N-ras exon 2 revealed that the insert DNA was N-ras exon 2 locus.

From these results, it is confirmed that N-ras exon 2 locus in the chromosomal DNA of human leukemia has been amplified by polymerase chain reaction and cloned fur the future analysis of the mutation of N-ras exon 2 in human leukemia.