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백서간장 세포내 간장형 포도당 운반체(GLUT2) Genomic DNA의 Cloning및 Promoter의 염기배열순서 결정

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 Cloning and sequencing of the promoter region of rat liver glucose transporter(GLUT2)genomic DNA 
Issue Date

포유동물에서 가장 중요한 영양소의 하나인 포도당을 facilitated diffusion 기전으로 세포 외부에서 세포내로 이동시키는 세포 원형질막에 존재하는 포도당 운반체(glucose transporter, GLUT)는 5종류(GLUT1, GLUT2, GLUT3, GLUT4, GLUT5)가 있으며, 간장세포에는

주로 간장형 포도당 운반체(GLUT2)가 존재한다. 본 연구에서는 GLUT2의 표현조절 기전을 이해하기 위하여 GLUT2 genomic DNA의 promoter 부위의 DNA 염기배열 순서를 결정하고자 하였다

GLUT2 DNA가 표현되는 백서의 간장 조직에서 genomic DNA를 추출하고 이 DNA를 여러가지 제한효소로 절단하여 plasmid vector(pGEM4Z)에 삽입하였다. Plasmic vector에 삽입된 DNA 중에서 GLUT primer 1과 이 primer의 upstream sequence를 포함하는 DNA만을 plasmic vector의 SP6 primer와 GLUT primer 1 존재하에 polymerase chain reaction(PCR)으로 증폭시켜 여러가지 크기의 DNA를 얻었다. 이들 DNA가 SP6 primer와 GLUT primer 1에 의해 증폭된 것을 Southern blot 분석으로 확인하였다.

이들 DNA를 GLUT primer 1과 GLUT primer 2를 이용하여 asymmetric PCR로 DNA의 한쪽 가닥만을 증폭시킨 다음 이 DNA를 template로 DNA sequencing을 하여 이들 DNA가 현재 알려진 GLUT2 cDNA의 5'-flanking sequence(118bp)를 포함하는 것을 확인하였다. 이 118 bp DNA가 포함되어 있는 증폭된 DNA를 pGEM4Z vector에 cloning한 후 plasmid를 분리하여 SP6 primer를 primer로 DNA sequencing을 시행하여 GLUT2 genomic DNA의 promoter 부위의 160개의 염기배열 순서를 결정하였다.


The mechanism of glucose uptake into the mammalian cells requires the presence of a group of membrane proteins, known as glucose transporters(GLUTS), which transport D-glucose down its concentration gradient by facilitated diffusion. The GLUTS are

classified into 5 types of isoforms according to their cDNA sequences.

In this study, the determination of the promoter sequence of GLUT2 genomic DNA was attempted to understand the possible regulatory mechanism involved in the expression of GLUT2. The chromosomal DNAs from rat liver were digested with various

restriction enzymes and inserted into pGEM4Z. The recombinant DNAs containing the upstream sequence of GLUT primer 1 were amplified in the presence of SP6 primer and GLUT primer 1. The amplified genomic DNAs were identified by Southern blot hybridization using the two primers(SP6 primer and GLUT primer 1) as probes. Also the presence of 5'-flanking sequence(118bp) of GLUT2 cDNA in the PCR-amplified DNA was identified by PCR using GLUT primer 1 and GLUT primer 2 and its nucleotide sequence was confirmed by dideoxy DNA sequencing method. The genomic DNA

corresponding to the GLUT2 promoter region was cloned in pGEM4Z and its nucleotide sequence(160bp) was determined.
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