백서 심장 Mitochondria 내 NADP Isocitrate Dehydrogenase에 관한 연구

Abstract

[한글]

동물조직에는 두종류의 isocitrate dehydrogenase가 존재한다고 보고되었다. 즉 NAD- linked isocitrate dehydrogenase (threo-D-isocitrate : NAD oxidoreductase, EC 1. 1. 1.41)는 mitochondria에 존재하고 NADP-linked isocitrate dehydrogenase (threo -D-isoci

trate : NADP oxidoreductase, EC 1. 1. 1.42)는 세포질과 mitochondria에 동시에 존재한다고 알려져 있다(Plaut, 1963 : Higashi 등, 1965 ; Bernofsky와 Utter, 1966 : Plaut와

Aogaichi, 1967).

NAD-ICDH는 분자량이 300,000이상으로(Chen과 Plaut, 1963 : Giorgio 등, 1970 ; Harver 등, 1970) 분자량이 40,000인 소단위로 구성되어 있으며(Shen등, 1974) AMP, ADP, citrate에 의하여 효소활성이 촉진되고(Chen과 Plaut, 1963 : Atkinson 등, 1955 : Bernof나y와 Utter,1966 ; Sanwal과 Cook, 1966 : Stein 등, 1967) ATP, NADH, NADPH에 의해 활성이 억제되는 allosteric enzyme으로서 TCA (tricarboxylic acid) cycle의 중요한 조절 효소로 알려져 있다 (Harvey 등, 1970 ; Kuehn 등, 1970 ; Plaut, 1970). 그러나 NADP- ICDH는 분자량이 90,000이하인 효소로서 종에 따라 하나 또는 두개의 소단위로 구성되어 있으며(Chung과 Franzen, 1969 ; Colman 등, 1970 ; Carlier와 Pantaloni, 1973 ; Ahn과 Kim, 1983), 세포질과 mitochondria에 동시에 존재하나 심장과 골격근육에는 주로 mitochon

dria에 존재하고, 간장세포에서는 주로 세포질에 존재한다고 보고되어 있다(Pette, 1966). 이 효소는 E. coli(Reeves 등, 1972), Azotobacter vinelandii(Chung과 Franzen, 1969), 돼지 심장(Siebert 등, 1957 ; Plaut, 1963 : Colman, 1968), 소 간장(Carrier와 Panta

loni, 1973), 소 심장(MacFarlane 등, 1977), 사람 심장 (Seelig와 Colman, 1977, 1978), 백서 간장 세포질(Ahn과 Kim, 1983)에서 순수 분리 정제 보고되었으나 백서 심장 세포에서는 아직 순수 분리되어 있지 않다. 이에 본인은 백서 심장 mitochondria에서 이 효소를

순수 분리하고 분자량 및 소단위 구성여부를 실험하여 다음과 같은 성적을 얻었다. NADP- ICDH는 쥐에서 얻은 심장 homogenate에서 mitochondria를 분리하여 초음파 처리, 열 처리, 황산 암모늄 처리, Sephadex G-25 gel filtration chromatography, DEAE-Trisa cryl M 이온교환 chromatography, CM-Sephadex C-50 이온교환 chromatography를 통하여 24.2배 분리 정제 하였다.

분리 정제된 백서 심장 mitochondria내의 NADP- ICDH와 specific activity는 31.0μmoles/min/㎎ protein이었고 이때 효소 활성은 34% 회수되었다. 24.2배 분리 정제된 이 효소가 SDS-polracrylamide gel 전기영동에서 단일 단백질 band로 나타난 사실로 미루어 이 효소는 순수 분리 정제 되었음을 알 수 있었다.

이와 같이 분리 정제된 백서 심장 mitochondria내 NADP- ICDH는 SDS-polyacrylamide slab gel (10.0%) 전기영동에서 단일 단백질 band로 나타났으며 분자량은 60,000±2,000이었으며 Sephadex G-200(superfine) gel filtration chromatography에서 얻은 분자량은 12

0,000±4,000이었다. 이 사실로 미루어 보아 백서 심장 mitochondria내 NADP-ICDH는 두개의 동일한 소단위로 구성되어 있음을 실험적으로 확인하였다.

[영문]

NADP-linked isocitrate dehydrogenase(NADP-ICDH) in the heart mitochondria of rat has not been highly purified and also not well characterized in terms of biological, physical and molecular properties. The present experiment was designed to purify the NADP-ICDH from the heart mitochondria of rat .The experimental

results are summarized as follows.

NADP-ICDH (EC 1.1.1.42) has been purified 24.2 folds (31.0 μmoles/min/mg protein) from heart mitochondria of rat by a series of steps including sonication, heat treatment, ammonium sulfate fractionation , Sephadex G-25 gel filtration, DEAE-Trisacryl M ion exchange and CM-Sephadex C-50 ion exchange chromatography. A single protein band was obtained when the purified NADP-ICDH was analysed by SDS-polyacrylamde slab gel (10.0%) electrophoresis indicating that the enzyme is

homogeneous. The molecular weight estimated by Sephadex G-200 (superfine) gel filtration chromatography and SDS-polyacrylamide slab gel (10.0%) electrophoresis was 120,000±4,000 which consists of two identical subunits having molecular weight

of about 60,000±2,000.

Further experiments are in progress to characterize the physico-chemical, biological properties of this enzyme.