과립구-단구 집락촉진인자가 급성백혈병 골수세포 장기배양에 미치는 영향

Abstract

[한글]

장기골수배양(long-term bone marrow culture)은 배양기내 형성된 부착간질세포층이 조혈미세환경으로 작용하여 집락촉진인자의 투여없이도 장기간 골수계 조혈기능을 유지할 수 있는 배양법이다. 급성백혈병세포를 장기배양하면 백혈병세포는 소실되고 정상 골수계

조혈기능은 회복되는, 골수정화효과가 있음이 관찰되었으며, 실제로 장기배양세포로 자가골수이식을 시행하여 골수생착이 일어나고 재발없이 경과관찰중에 있는 예도 보고되어 있다. 그러나 장기배양에서는 배양세포 및 조혈전구세포수가 급격히 감소되어 골수생착 및 말초혈구 회복이 지연될 수 있다는 것이 문제이며, 특히 재발을 방지하기 위하여서는 백혈병조혈세포는 보다 감소되어야 한다. 과립구-단구 집락촉진인자(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor; GM-CSF)는 과립구-단구계 조혈전구세포의 증식과 성장을 촉진하고 아울러 백혈병세포의 중식도 자극하는 것으로 알려진바, 장기배양이 백혈병조혈기전을 억제하고 GM-CSF 자극으로 정상 골수계 조혈기능 회복을 촉진한다면, 장기골수배양에 GM-CSF 자극을 병용함으로서 백혈병조혈기전 억제효과를 보다 증가시킬 수 있을 것이다.

본 연구는 급성백혈병환자의 골수세포를 GM-CSF로 24시간 단기배양(자극)한 후 장기골수배양을 시행하여, 자극된 백혈병골수세포(자극군)가 자극하지 않은 백혈병골수세포(대조군)에 비해보다 더 감소하는 반면, 자극된 골수계 조혈세포는 보다 증가하는지를 검토하고, 정상골수세포배양시(정상군)와 비교함으로서, 장기배양을 골수정화법으로 이용할 경우의 적절한 세포채집 시기를 제시하고자 하는 목적으로 시행되었다. 실험은 급성백혈병환자 22예의 골수단핵세포를 채취하여2∼3×10**6/ml 세포당 100ng/m1 GM-CSF(Sobering; SCH 39300)를 첨가 24시간 배양 후 세척하고 장기배양을 시행하였으며, GM-CSF를 첨가하지 않은 예는 대조군으로 하였다. 배양기당 2∼3×10**7개의 세포를 장기배양하였으며 매주 배양액 교환시 역위천미경으로 배양상을 관찰하였고, 비부착세포 반은 추출하여 세포수 산정, 세포원침후 형태학적 관찰 및 반고형배지 조혈전구세포배양을 시행하였다. 4주째인 배양종료시에는 부착세포층을 효소처리하여 부유시킨후 같은 방법으로 관찰하였다. 이상의 실험으로 다음과 같은 결과를 얻었다.

1. 역위현미경하 배양상 관찰시 GM-CSF 자극군은 대조군에 비해 배양 1주째 비부착세포의 증가가 현저하였으며, 부착세포층의 형성 및 융합도 정상골수 장기배양시의 소견과 유사하였다. 배양 2주 이후 양군간의 차이는 소실되었다.

2. 비부착세포수는 배양 1주째 자극군에서 배양기당 평균 153±8x10**5, 장기배양전 세포수의 69±6%로 대조군의 104±6×10**5, 50±5%에 비해 유의하게 많았다(p<0.01). 배양 2주 이후의 양군간의 차이는 소실되었다.

3. 백혈병아세포분율 및 절대치는 배양 전기간에 걸쳐 양군간의 차이를 보이지 않았으며, 배양 2주째까지 현저히 감소하였으나 그후에는 더이상 감소되지 않았다.

4. 과립구절대치는 배양 1주째 자극군에서 배양기당 평균 32.8±3.7×10**5으로 대조군의 17.5±2.9×10**5에 비해 통계적으로 의미있게 증가하였다. 배양 2주 이후 양군간의 차이는 없었고, 배양 3주이후 과립구의 현저한 감소가 관찰되었다.

5. 비부착세포중 골수아구 및 대상/분절과립구가 동시에 정상골수 장기배양시(정상군)의 수준으로 되는 경우는 자극군 및 대조군에서 모두 배양 2주째가 가장 많았다.

6. 장기배양 1주째 정상 과립구-단구 세포집락은 자극군 6예 및 대조군 5예에서 관잘되었으며, 배양기당 세포집락수는 자극군에서 평균 5,275±1,156로 대조군의 3,039±1,024에 비해 유의하게 많았다. 배양 1주째 백혈병세포집락은 양군 모두에서 4예씩 관찰되었으며, 자극군에서 평균 240±196으로 대조군의 497±400과 비교하여 통계학적 의의는 없었으나 48%로 감소하였다.

7. 배양 4주째 측정한 부착세포수는 자극군에서 배양기당 평균 13.4±2.4×10**5로 대조군의 12.9±2.3×10**5과 차이가 없었다. 정상 과립구단구 세포-집락수 및 백혈병 세포집락수도 양군간의 차이를 보이지 않았다.

이상의 결과로 급성백혈병골수세포의 장기배양전 GM-CSF 단기자극은, 부착세포충이 완전히 형성되기 전인 배양 1주째 일부예에서 골수계 조혈전구세포의 증식 및 분화와 동시에, 백혈병전구세포의 감소를 유도할 수 있는 가능성을 제시하였다. 그러나 배양 2주 이후 초기 자극효과는 소실되는 것으로 보아, 배양 2주째가 자가골수이식을 위한 세포채집시기로 적절한 것으로 판단되었다. 그리고 앞으로 골수정화 효과를 보다 증가시키기 위해

서는 간질세포 및 간질세포와 연관된 시조혈모세포 수준에까지 작용할 수 있는 다양한 다른 조혈촉진인자의 병용이 검토되어야 할 것으로 생각된다.

[영문]

Long-term bone marrow cultures(LTBMCs) have been found to be mimic many of the features of marrow hemopoiesis. In this system complex mesenchymal cellular environment forms that is essential for the sustained output of hematopoietic cells. Recent reports of intensive therapy and hematopoietic rescue with autologous

marrow cells grown in the LTBMC system have aroused much attention. But its efficacy as a purging modality remains to be improved for better outcomes.

Granulocyte-rnacrophage colony-stimulating factor(GM-CSF) has become available as separable molecules as the results of molecular cloning. This factor is crucial in the regulation of proliferation and maturation of normal heinatopoietic progenitor

cells, and also exerts profound stimulative effects on leukemic cells.

To evaluate the effects of GM-CSF on the LTBMC-mediated myelopoietic recoveries and purging of leukemic cells, bone marrow mononuclear cells of 22 patients with acute leukemia were primed prior to initiation of long-term cultures. The results

are as followings;

The incubation of leukemic bone marrow cells with GM-CSF for 24 hours prior to LTBMC resulted in an increase in (a) the number of nonadherent cells, (b) the number of terminally differentiated granulocytes(band and segmented neutrophils), and (c) the number of nonadherent granulocyte-macrophage colony-forming units(CFU-GM) in cases of forming "normal" granulocyte-macrophage colonies

considerably(P<0.05) and there seemed to be increased cellularity of adherent fractions compared with untreated leukemic marrow.

Thus, GM-CSF stimulation prior to LTBMC may be a more effective way to purge leukemic marrow than results without GM-CSF before establishment of confluent adherent layers. These effects were lost after 2 weeks of LTBMC, suggesting that it may not be active on primitive hemopoietic stem cells responsible for LTBMC propagation. Alternatively, stromal cells may exert tight regulatory control over progenitor cells. Further analysis will be required to enhance recovery of normal myelopoiesis and decrease survival of leukemic progenitor cells more effectively on the basis of combined use with different hemopoietic growth factors or with other various cytokines, because those might be affecting regulatory functions of stromal cells and more primitive progenitors.